【摘 要】
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辅酶Q(IYoidecarenone,conezyme Q),又名泛醌,是呼吸链中一种重要的递氢体.辅酶Q具有抗氧化、防衰老、提高机体免疫力等功能,被广泛用于各类心脏病,高血压、肝炎等疾病的治疗.本文对产辅酶Q的菌种选育和发酵过程进行了初步研究.研究了辅酶Q的定量分析方法:Craven试验显色法和高效液相色谱法(HPLC).将Craven反应的溶剂改进为丙酮,使该反应的灵敏度提高了近50﹪.该方法
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辅酶Q<,10>(IYoidecarenone,conezyme Q<,10>),又名泛醌,是呼吸链中一种重要的递氢体.辅酶Q<,10>具有抗氧化、防衰老、提高机体免疫力等功能,被广泛用于各类心脏病,高血压、肝炎等疾病的治疗.本文对产辅酶Q<,10>的菌种选育和发酵过程进行了初步研究.
研究了辅酶Q<,10>的定量分析方法:Craven试验显色法和高效液相色谱法(HPLC).将Craven反应的溶剂改进为丙酮,使该反应的灵敏度提高了近50﹪.该方法特异性强,操作简单,可在短时间内测定大批样品;确立了HPLC法测定辅酶Q<,10>条件和相应标准曲线,测定方法准确可靠.
研究了可以批量提取样品中辅酶Q<,10>的化学破胞方法,工艺路线为EDTA预处理→NaOH作用破胞→丙酮抽提萃取.通过Plackett-Burman设计试验和最终优化实验得到较佳的提取工艺条件:0.mol.L EDTA作用温度为30℃,1ml发酵液中2mol/L NaOH用量和生物量的关系为V=4.335m,R<2>=0.971,其作用时间和温度分别为50min和52℃.与碱醇皂化、高压匀浆等方法提取结果比较,化学破胞方法因其条件温和、破胞彻底而提取效果更好.
以土壤根瘤杆菌AT-hh01为出发菌株,确定了紫外诱变的最佳条件:30W紫外灯,诱变距离为65cm,照射时间为20s;<60>Co γ射线诱变的较佳诱变剂量为300 Gy.经过多轮,γ射线和紫外诱变,在亮氨酸和D-半乳糖的复合筛选平板中筛选得到了一株突变菌株AT-hh1201-4,辅酶Q<,10>产量为27.2mg/L,较出发菌株AT-hh01提高了51.96﹪,经过传代10次,证明其遗传性状稳定.
对土壤根瘤杆菌AT-hh1201-4的摇瓶培养及制备辅酶Q<,10>过程进行了优化.通过考察不同的碳源、氮源对辅酶Q<,10>产量的影响,确定了较好的碳源为葡萄糖和蔗糖,氮源为酵母膏和(NH<,4>)<,2>SO<,4>.以均匀试验设计对Plackett-Burman设计试验筛选所得关键因素一酵母膏、(NH<,4>)<,2>SO<,4>和种龄作了进一步优化,采用二次多项式逐步回归的方法对结果进行拟合,获得优化化条件为:酵母膏46.2g/L,(NH<,4>)<,2>SO<,4>25.4g/L种龄为24h,经实验验证,回归拟合结果较好.经优化后辅酶Q<,10>的平均产量为32.24mg/L,比初始的27.2mg/L提高了18.53﹪.
考察了发酵过程中溶氧对辅酶Q<,10>产量的影响.将发酵培养过程分成两个阶段对溶氧条件进行考察,第一阶段获得以最大生长速率为目标的通气条件,第二阶段为在第一阶段培养结束后改变通气条件以进一步提高辅酶Q<,10>产量.以正交试验确定第一阶段培养条件为:装液量25ml/250ml,转速210rpm和摇瓶形状为C<,3>;以二次饱和D-最优设计试验得到第二阶段培养条件为:在第一阶段培养到104h时将转速调为180rpm.经过对溶氧条件的优化,发酵液中辅酶Q<,10>产量达到38.22mg/L,比优化前提高了18.5﹪.
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