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背景:急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是一种临床上备受关注的肾脏疾病,漏诊率高、死亡率高是其临床普遍特征,一直以来是全球医学研究的热点问题之一。目前,仍没有有效地治疗手段能改善AKI的高死亡率。普遍认为,尽早诊断和及时治疗对于改善AKI的预后有重要意义。但是临床常用的血清肌酐并不是理想的生物标志物,其水平升高晚于AKI发生,且灵敏度较低。新发现的生物标志物因临床数据较少,虽然在AKI发病不同阶段各具有优势,但没有具体参考值可供参考。因此,亟需寻求新型生物标志物作为AKI发生和发展早期预测因子。近年来发现组织基质金属蛋白酶抑制因子 2(Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase-2,TIMP-2)与 AKI关系非常密切,其水平变化早于AKI发生,可作为早期预测心脏手术后和ICU病人AKI发生和发展的生物标志物。但其他原因导致AKI时,肾脏中TIMP-2的含量是否也会升高,尚不明确;且目前针对TIMP-2作为预测AKI的生物标志物的具体作用机制也并不明确。方法:本研究首先构建了造影剂导致急性肾损伤的大鼠模型,应用免疫组化的方法观察TIMP-2在肾组织中的表达是否增加,从而在造影剂肾病动物模型上确定是否TIMP-2也能作为AKI的生物标志物。之后采用TIMP-2活性蛋白或构建TIMP-2过表达质粒干预HK-2细胞,确定TIMP-2对HK-2细胞增殖过程的影响,并明确TIMP-2实现这一影响是否不通过抑制金属蛋白酶而间接实现。采用GST pulldown技术、高效液相色谱-质谱联用技术、蛋白质免疫印迹技术筛选和验证与TIMP-2互作的靶向蛋白,通过免疫荧光共定位技术研究TIMP-2与靶向蛋白的作用位置。最后采用靶向蛋白抑制剂干预,观察HK-2细胞增殖情况变化,并通过蛋白质免疫印迹技术探究TIMP-2-靶向蛋白可能调控的信号通路。结果:大鼠发生造影剂导致的急性肾损伤后,肾小管上皮细胞中TIMP-2的含量明显增加。在HK-2细胞中直接加入TIMP-2活性蛋白或通过HK-2细胞高表达TIMP-2蛋白,证实高水平TIMP-2可抑制HK-2细胞增殖,使细胞出现G1期阻滞,并促进细胞凋亡。TIMP-2未通过抑制基质金属蛋白酶来间接实现抑制细胞增殖的功能。通过GST pulldown技术捕获与TIMP-2互作的蛋白,捕获的产物经高效液相色谱-质谱分析筛选出222种蛋白,根据这些蛋白是否行使与细胞增殖相关的功能筛选和确认了 4种蛋白,分别是TIMP2_HUMAN,KIT_HUMAN,ABI1_HUMAN,ROCK2 一HUMAN,进一步分析发现KIT的细胞定位及所行使的功能与实验所观察到的细胞功能改变最为相符,因此本研究首先选择了 KIT蛋白进行下一步研究。通过蛋白质免疫印迹技术证实了 KIT可以与TIMP-2相互作用,进一步采用免疫荧光共定位技术验证了 TIMP-2与KIT作用主要发生在细胞膜上。最后通过KIT抑制剂干预处理,结果显示TIMP-2与KIT抑制剂作用效果一致,均抑制细胞的增殖过程;通过蛋白质免疫印迹技术显示,其实现该效应可通过抑制下游细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)的表达及ERK1/2蛋白的磷酸化、抑制细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)的表达而实现,未对c-FOS蛋白的表达及其磷酸化产生影响。结论:造影剂导致急性肾损伤时肾小管上皮细胞中TIMP-2表达也会升高。TIMP-2作为预测AKI的生物标志物,与TIMP-2表达升高可抑制肾小管上皮细胞增殖、促进细胞凋亡相关。其主要通过与KIT互作,抑制下游ERK1/2表达和磷酸化、抑制CCND1表达发挥生物学作用;TMP-2-KIT轴未通过调控C-FOS发挥生物学功能。