【摘 要】
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发光菌作为水环境生物毒性监测的有效手段,近年来越来越得到重视。其发光强度与受试毒物的浓度表现为负相关关联,所以可通过发光强度的变化值来判断受试毒物的毒性,最终反映
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发光菌作为水环境生物毒性监测的有效手段,近年来越来越得到重视。其发光强度与受试毒物的浓度表现为负相关关联,所以可通过发光强度的变化值来判断受试毒物的毒性,最终反映发光菌所处环境的生物毒性。由于Frex能与NADH相结合激发强荧光,故通过荧光酶标仪测定菌体内NADH水平所引起的荧光强度的变化,来监测水体中有毒物质对微生物代谢的影响,从而实现实时毒性监控。本实验利用基因工程技术,将质粒pRSETb-Frex转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中,通过Western-blot验证荧光蛋白Frex已成功表达,利用Ni2+亲和层析柱在咪唑浓度为300mM时洗脱得到纯化Frex蛋白。研究了Frex蛋白与一定浓度下底物NADH、NAD+、NADP+、ADP作用时荧光强度随时间变化的关系,同时验证了 Frex蛋白对NADH的专一性,并绘制了不同NADH浓度对Frex荧光激发作用随时间变化的关系曲线。变化值非常明显,说明Frex对NADH十分敏感,两者非常容易结合产生强荧光。实验研究了诱导温度、诱导时间及IPTG浓度等不同条件对Frex蛋白表达量和荧光活性的影响,将此重组荧光发光菌初步应用于环境水体中有毒物质和实际废水水样的检测研究,选取氯化汞、苯酚、重铬酸钾、硫酸锌等4种国际荧光发光菌生物毒性检测标准物质进行检测,结果表明毒性物质和废水水样均能对菌体的荧光产生一定的淬灭作用,该毒物测试手段分别具有反应速度快和灵敏度高等特性。同时,实验优化了该重组菌应用于生物毒性检测试验的条件,为后续的应用研究提供了一定的实验基础,拓展了荧光发光菌在其他方面的适用范围。
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