【摘 要】
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腰果过敏是一种常见的树坚果过敏,随着腰果消费量的逐年增加,腰果过敏的发病率也在逐年上升。Ana o 3作为腰果过敏主要的致敏蛋白之一,可被81%的腰果过敏患者所识别。腰果过敏原致敏性与其致敏性表位密切相关,理论而言,通过重组表达生产出删除主要表位肽段的过敏原突变体,可以制备低致敏Ana o 3。因此,过敏原及其突变体的制备和致敏性评估具有研究价值。本文的主要研究方法、结果及结论如下:1.以生腰果为
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腰果过敏是一种常见的树坚果过敏,随着腰果消费量的逐年增加,腰果过敏的发病率也在逐年上升。Ana o 3作为腰果过敏主要的致敏蛋白之一,可被81%的腰果过敏患者所识别。腰果过敏原致敏性与其致敏性表位密切相关,理论而言,通过重组表达生产出删除主要表位肽段的过敏原突变体,可以制备低致敏Ana o 3。因此,过敏原及其突变体的制备和致敏性评估具有研究价值。本文的主要研究方法、结果及结论如下:1.以生腰果为原料,先后通过粉碎脱脂、低盐提取粗蛋白、冷冻干燥、阴离子交换层析及超滤浓缩等过程分离得到腰果过敏原Ana o 3,并利用电泳、液相色谱-串联质谱技术和免疫印迹进行鉴定。结果表明,本研究成功建立一种快速高效纯化腰果过敏原Ana o 3的方法,该方法所用的磷酸盐缓冲液p H值为6.8,洗脱流速为2 m L/min,洗脱时氯化钠浓度为0.1-0.3 M,制备的Ana o 3蛋白纯度高于95%,蛋白提取率为25.36%。2.通过比较分析大肠杆菌和毕赤酵母表达腰果过敏原Ana o 3的效果,确定选用合适的表达系统进行Ana o 3突变体的表达。本研究将p ET-32a-Ana o 3质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达出Ana o 3;进一步通过PCR扩增出Ana o 3目的基因,将其克隆至p Pic9k载体上,再导入至大肠杆菌DH5α中进行测序鉴定,将测序正确的质粒电转至毕赤酵母GS115后发酵表达出Ana o 3。结果表明,大肠杆菌和毕赤酵母均能成功表达出Ana o 3,但因毕赤酵母发酵周期长,成本高,收益低,故三种Ana o 3突变体的生产均采用大肠杆菌表达系统。3.根据文献报道的Ana o 3的表位信息,选择AA33-44（SGREQSCQRQFE）,AA57-68（KQEVQRGGRYNQ）,AA121-135（PRICSISPSQGCQFQ）三个肽段分别作为突变体的删除片段以合成质粒。突变体质粒转化至大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达并用镍离子亲和纯化获得Ana o 3突变体。4.以天然、重组Ana o 3及三种突变体为研究对象,利用免疫印迹分析5种蛋白的Ig E结合能力;通过检测KU812细胞脱颗粒模型中组胺,白介素（IL-6,IL-8）,β-氨基己糖苷酶（β-HEX）的释放水平变化评价潜在致敏性;结果综合表明,天然和重组Ana o 3的免疫活性无明显差异,三种突变体的致敏性相对于天然Ana o 3都有明显降低,其中突变体2（删除片段为AA KQEVQRGGRYNQ）免疫活性最低,其组胺,β-HEX,IL-8及IL-6的释放量分别为12.40 ng/m L,1303.89 pg/m L,293.56 pg/m L,375.34 pg/m L。总之,本研究建立了高效分离腰果过敏原Ana o 3和可溶性表达重组Ana o3突变体的方法,制备的腰果过敏原Ana o 3可作为标准品的后选物,重组表达的Ana o 3突变体则可作为低致敏性Ana o 3的候选物。
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