关节软骨组织自我修复能力有限,但目前在临床上仍缺乏有效的治疗手段。近年来发展起来的组织工程和细胞治疗技术有望能真正实现软骨组织再生,其中细胞是这一新技术的核心要素之一,目前最具应用前景的细胞包括关节软骨细胞(Articular chondrocytes,ACs)和间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)。但是,这两种细胞在实际应用中各有优点,也各有不足,因此有研究者提出将两种细胞相结合,并已经开展了一系列将MSCs与ACs进行共培养的相关研究工作,期望深刻理解两种细胞的相互作用并实现合理调控,从而为基于细胞的软骨再生治疗策略提供一种新的途径。2016年所报道的MSCs与ACs混合体临床试验具有可行性的结果更是令人鼓舞。然而,由于实验设计的千差万别,尤其是共培养方式、培养基成份以及细胞来源的不同,导致了对相关实验发现的直接比较非常困难,因而到目前为止对于MSCs与ACs之间相互作用的认识并不系统,并且大多数研究只关注共培养中ACs对MSCs的单向作用,而普遍忽略了 MSCs对ACs可能存在的调节作用。为此,本文将以我们团队的前期研究工作为基础,采用Transwell共培养方法开展针对MSCs调控ACs生物学行为的研究,验证MSCs调控软骨表型的普遍性,剖析MSCs调控ACs的相关作用机理,表征共培养的ACs生物学特征,并在复杂共培养方式包括混合共培养模式和海藻酸钙凝胶微球包裹细胞的Transwell共培养模式中探讨其相互作用。首先,基于Transwell间接共培养体系,实验发现兔骨髓来源的MSCs(Rabbit bone marrow-derived MSCs,rbBMSCs)能够显著调控兔 ACs(Rabbit ACs,rbACs)的分化表型,主要表现在rbBMSCs能够诱使rbACs的形态由圆形转变为成纤维细胞样,同时显著下调rbACs分泌基质的能力,并且能刺激其增殖,结果证明这一调控作用主要源于rbBMSCs的旁分泌作用。在此基础上,为了进一步验证这一调控现象的普遍性,实验选取了不同种属及组织来源的MSCs(人骨髓MSCs、人脂肪MSCs和大鼠骨髓MSCs),分别与不同来源的软骨细胞(rbACs、牛ACs和鼠软骨肉瘤细胞ATDC5)在Transwell体系中进行间接共培养,结果发现三种来源的MSCs均能诱使不同来源的软骨细胞发生形态变化,使细胞更加趋向于成纤维细胞样形态,这些MSCs均促进了软骨细胞的增殖,而且抑制了所有软骨细胞分泌透明软骨特征基质(糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAG)和Ⅱ型胶原)的能力。这些结果表明MSCs调控软骨细胞的作用具有一定的普遍性。当然,不同MSCs的调控能力以及不同软骨细胞的响应程度均有差别,这可能与不同种属和组织来源的细胞存在差异有关。为了探讨MSCs调控ACs生物学行为的作用方式和机制,本文以rbBMSCs与rbACs在Transwell体系中的间接共培养方式为代表,将不同接种量的rbBMSCs(2×104、2.5×105、5×105和1×106 cells/well)分别与rbACs进行共培养,发现无论是rbACs的形态转变程度还是细胞增殖能力,都与rbBMSCs的接种量正相关,这也间接证实了 rbBMSCs作用于rbACs的方式源于rbBMSCs的旁分泌因子。通过在共培养体系中添加ROCK抑制剂Y27632,发现Y27632能够阻止rbACs形态的转变,同时rbACs的基质分泌能力能够部分维持,特别是在rbBMSCs接种量较低的情况下能保持与单独培养组类似,而且添加了 Y27632的共培养条件下rbACs的基因表达水平与单独培养的rbACs 一致,但细胞增殖没有变化,这表明RhoA/ROCK信号通路参与了 rbACs的形态变化。通过在共培养体系中添加FGFR1/2/3、VEGFR1/2/3和PDGFRα/β的共同抑制剂BIBF1120,同样能够抑制rbACs的形态改变,上调GAG合成能力,显著抑制细胞增殖,而且相关基因表达也更趋于与单独培养的rbACs 一致,说明生长因子FGF、VEGF和PDGF可能参与了rbBMSCs对rbACs的调控作用。通过在单独培养的rbACs中加入FGF-1、VEGF-A和PDGFbb及其组合,发现尽管基因表达变化并不完全一致,但同时添加FGF-1、VEGF-A和PDGFbb三种因子最能模拟与rbBMSCs共培养的作用效果。因此可以推测,rbBMSCs是通过分泌旁分泌因子介导对rbACs生物学行为的调控,而这些因子可能就包括了FGF-1、VEGF-A 和 PDGFbb 等生长因子。为了进一步认识rbACs在共培养条件下的生物学特征变化,本文从三个方面对共培养的rbACs进行了深入表征。(1)将与rbBMSCs共培养的rbACs进行传代培养和诱导分化,发现在培养过程中细胞能较好地维持成纤维细胞样的形态,与单独培养的rbACs相比具有更强的增殖能力,表明rbBMSCs的间歇刺激效果能够在rbACs后期传代中保留,而且共培养的rbACs进行成软骨诱导再分化后能够重新表达软骨表型,且其成软骨分化能力优于单独培养的rbACs。(2)采用流式细胞技术对与rbBMSCs共培养的rbACs进行表面分子(CD14、CD81、CD49f、CD51/61、CD49e、CD166、CD90、CD44 和CD29)检测,发现其表面分子表达与单独培养的rbACs、去分化的rbACs以及rbBMSCs相比均不同,因此可以推测与rbBMSCs共培养的rbACs并不是发生了去分化,也没有转变成与MSCs类似的细胞,共培养上调了 rbACs的CD51/61、CD81的表达,下调了CD90的表达。(3)对与rbBMSCs共培养的rbACs进行全基因表达谱分析,并与单独培养的和去分化的rbACs进行对比,发现这三种细胞在细胞因子及受体、胞外基质、整合素、炎症相关、增殖相关以及信号传导分子等类别的基因表达存在差异,共培养上调了rbACs的生长因子受体基因(如IGF1R)、增殖相关的基因(如KSR1)、粘附相关的基因(如PECAM1和VCAM1)、胞外基质合成和降解相关基因(如MMP1、MMP3、HS3ST5和CHST1)、炎症相关因子(如NOS2、IL4R、IL7、IL18和IL6)等基因,下调了信号途径相关关键分子(如SFRP5)的表达,这些基因表达的变化也与细胞在增殖和基质分泌方面的变化一致。最后,本文考察了 rbBMSCs和rbACs在两种复杂模型中的共培养。(1)将rbBMSCs和rbACs直接混合接种在二维平面上,并在软骨细胞生长培养基中进行共培养,结果发现这种混合共培养有利于细胞增殖,而混合共培养细胞分泌GAG的能力随共培养中细胞比例的变化而变化,在rbACs和rbBMSCs比例较高(1:1)时,共培养有利于GAG分泌,但较低(1:2)时却表现为抑制GAG分泌,这表明共培养中存在多重作用机制,旁分泌效应和细胞的直接接触均发挥作用,而这两种作用的贡献程度与两种细胞比例有关。(2)将rbBMSCs和rbACs分别包裹在海藻酸钙凝胶微球中然后进行Transwell共培养,结果在软骨细胞生长培养基中重现了 rbBMSCs抑制rbACs软骨表型的现象,而在成软骨诱导培养基中rbBMSCs促进了 rbACs软骨表型的维持,这表明培养基成份,而不是三维条件,能够影响共培养中细胞之间的相互作用。通过对共培养体系中的rbBMSCs进行分析,发现在软骨细胞生长培养基中共培养时rbBMSCs没有显著分化趋向,而在成软骨诱导培养基中共培养的rbBMSCs却表现出了更好的GAG分泌能力,因此可以推测在两种培养基中rbBMSCs状态的不同造成了其对rbACs调节作用的差异。综上所述,本文通过对MSCs调控软骨细胞作用的系统、深入考察,证实了 MSCs下调软骨细胞分化表型的作用具有普遍性,并明确了 rbBMSCs对rbACs的作用源于旁分泌相关蛋白因子(如FGF-1、VEGF-A和PDGFbb等)的介导,而且发现与rbBMSCs共培养的rbACs再培养时表现出了较好的增殖和成软骨分化能力,且这种细胞不等同于去分化的rbACs,也不同于MSCs,拥有其特有的表型。本文研究的相关结果对于未来应用MSCs和ACs的混合体再生治疗软骨组织缺损有着重要的指导和借鉴意义。