结核病是由结核分枝杆菌感染导致的一种古老的传染性疾病。结核病传播是全球性的公共卫生问题,中国是30个结核病高负担国家之一,而云南省位于我国西南地区,经济相对落后,医疗资源分布不均衡,属于结核病的高发省份。因此,对云南省结核患者,特别是耐药结核患者,进行早期诊断尤为必要,为后续的治疗提供用药依据、赢得治疗时间。目前临床上用于诊断结核病的技术是分别基于表型和基因型的检测方法,主要包括涂片显微镜检测、罗氏培养检测、BATCEC MGIT 960培养检测和Gene Xpert MTB/RIF检测等。分子诊断具有速度快和准确性高的特点,因此是目前常用的诊断方法之一。由于现有的分子诊断方法存在一些不足和弊端,本研究中拟建立一种新的结核分枝杆菌的快速诊断方法。在本研究中,我们分析了392例结核病患者的临床资料,结果显示男女患者比例为2.35:1,男性患者多于女性。患者职业以农业劳动者为主,占患者总人数的51.3%（201人）。所有患者中仅8位患者没有出现并发症和合并症,384位患者存在不同程度的并发症和合并症,占总人数的97%。继发性肺结核和继发性肺结核伴其他结核病的患者为337例,肺外结核病患者55例。肺结核患者的主要临床症状包括咳嗽、咳痰、发热、胸闷和胸痛等。肺外结核病患者根据病灶累积部位表现出相应的临床症状。结核病的发病率与患者的生活环境和条件呈负相关,在经济落后的地区,大部分人主要从事体力劳动,条件艰苦,并且医疗水平落后,存在大量的误诊、漏诊的情况,这不仅加重病人的病情,而且还导致疫情的扩散。临床信息的分析可以为结核病诊断和治疗提供线索,也对结核病防控方面提供一定的基础。对结核患者的临床样本进行收集,主要样本为痰液,此外还有少量脓液、肺泡灌洗液、胸水、腹水和脑脊液等。摸索不同的样本提取方法后,选择应用试剂盒进行结核分枝杆菌基因组DNA的提取。通过生物信息学分析,我们筛选获得结核分枝杆菌的高度保守且特异性序列区段TB18.5基因。根据NCBI提供的序列进行巢式PCR的引物设计,用普通PCR和Real-time PCR对引物的特异性和灵敏度进行检测。通过构建TB18.5基因的质粒进行引物灵敏度分析,证实在仅有10个拷贝模板存在的条件下,即可扩增出较清晰的目的条带。选取6种常见的临床致病菌和3种非结核分枝杆菌进行引物特异性分析,结果显示该引物仅对结核分枝杆菌基因组DNA具有扩增效果。将本论文中建立的结核分枝杆菌检测方法与现有临床常用诊断方法比较。在已收集的结核患者样本中选取230例确诊的肺结核患者进行诊断方法的比较实验,同时选取10例非结核病患者作为随机对照分析。用BD-960、Gene Xpert和TB18.5-PCR方法对选取的230例样本进行结核分枝杆菌的检测,BD-960培养检测阳性率为62.69%（163/230）,Gene Xpert检测阳性率为82.61%（190/230）,而本实验的检测阳性率为85.65%（197/230）。论文中建立的TB18.5-PCR对结核分枝杆菌的检出率明显高于BD-960（P<0.0001）。虽然TB18.5-PCR检出率高于Gene Xpert,但二者之间无明显的统计学差异。同时我们还建立了结核一线常用药物耐药基因突变的检测方法,设计rpo B、kat G、pnc A、emb B和rps L基因的扩增引物,对收集到的耐药结核样本进行基因突变的检测。检测结果显示利福平耐药基因rpo B的突变率为97.83%;异烟肼耐药基因kat G的突变率位92.31%;链霉素耐药基因rps L基因的84.21%;乙胺丁醇耐药基因emb B基因的突变率为66.67%。本论文首先通过生物信息学方法,确定了结核分枝杆菌的特异性基因TB18.5并对其进行引物设计,通过灵敏度和特异性实验证实了该基因的特异性和引物的灵敏性。通过比较本论文建立的TB18.5-PCR方法、Gene Xpert及BD-960方法,证实本论文建立的方法对临床样本的检出率高于其他两种临床常用方法。同时,我们创建的耐药基因突变检测方法也能快速准确的判断结核分枝杆菌是否存在耐药突变。通过本论文的研究,为临床结核病的快速诊断提供了一种新的方法,有助于提高临床结核病和耐药结核病的诊断率,为后续的用药提供参考。