特应性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一种常见的慢性复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病,近年来世界范围内发病率呈快速上升趋势。AD发病机制尚不完全清楚,可能为遗传背景、免疫系统平衡失调、皮肤屏障功能障碍以及环境因素等共同作用的结果。遗传免疫异常及皮肤屏障功能障碍是当前AD发病机制的研究热点。　　 AD免疫反应异常主要表现为Th1/Th2功能的失调,表现为高水平IgE的产生,肥大细胞的过度活化,以及皮肤内树枝状细胞的异常信号介导等。Th1/Th2功能失衡引起细胞因子分泌异常在AD的不同时期皮损内表达水平有差异。急性期皮损以Th2型免疫反应为主,白细胞介素(Interleukin,IL)4、13呈优势表达;而慢性期皮损则Th1型免疫反应明显增强,干扰素(Interferon,IFN)γ呈相对优势表达。　　 AD患者存在广泛的皮肤屏障功能障碍,并与炎症的严重程度呈正比。表皮屏障功能障碍主要表现为皮肤终生干燥,角质层细胞(stratum corneum,SC)水合度下降,透皮水丢失(Transepidermal.water loss,TEWL)明显增高,SC细胞间黏附性下降,过度脱屑等。屏障功能障碍可使外界抗原及病原体表皮通过性增高,进而诱发免疫及皮肤屏障功能的进一步损伤。　　 丝聚合蛋白(Filaggrin,FLG)由定位于人1q21位点上FLG基因编码,是正常表皮末端分化及维持皮肤水合度的关键蛋白,是维持表皮屏障功能完整性的重要蛋白。Profilaggrin形成于颗粒层透明角质颗粒,FL6单体依赖转谷胺酰酶(Transglutaminases,Tgases)交连聚集角蛋白中间丝,为SC细胞角质包膜(cornified envelope,CE)提供紧密的骨架系统。FLG水解后产生的酸性终产物是皮肤天然保湿因子(natural moisturizing factor,NMF)活性成分的主要来源并是维持角质层弱酸性环境的主要因素之一。FLG功能的发挥及降解代谢过程涉及多种酶类及离子信号。在钙离子浓度增高的情况下,profilaggrin被脱磷酸化并进一步经丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)水解。这些SPs主要包括matriptase,通道活化的丝氨酸蛋白酶1(channel-activating serine protease,CAP1),角质层糜蛋白酶(stratum corneum chymotryptic enzyme/SCCE,又称kallikrein7/KLK7)及角质层胰蛋白酶(stratum corneum tryptic enzymes/SCTE,又称kallikrein5/KLK5)分解profilaggrin释放出多拷贝的功能性FLG重复肽片段单位,为CE提供骨架系统构成成分。并最终在半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶14(caspasel4)作用下产生具有吸湿性的降解产物游离氨基酸及尿刊酸(urocanic acid,UCA),吡咯烷酮羧酸(pyrrolidone carboxylic acid,PCA),构成NMF的主要组成成分。而由丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal5型基因(serineprotease inhibitor Kazal type5,SPINK5)编码的淋巴上皮Kazal型相关抑制剂(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,LEKTI)蛋白是调控这些蛋白水解酶活性最重要的抑制剂。　　 AD皮损中FLG广泛的低表达已被证实。尽管众多研究表明不同人种AD患者中FLG的无功能性基因变异普遍存在,是AD皮损中FLG低表达的重要原因,但这些突变仅在不足1/3患者中发现,且具有明显的遗传异质性。近年研究发现Th2/Th1型细胞因子也可明显影响角质形成细胞(Keratinocyte,KC)FLG的表达,IL4,IL13可降低FLG的表达,IFN-γ可提高FLG的表达。然而发生这种效应的机制尚不清楚。　　 有证据表明AD患者TEWL的明显增高引起机体缺水,全身的水代谢异常可进而导致内分泌改变。日本学者发现在重度AD患者中存在由于大量TEWL导致的继发性抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)增高。人体调节水代谢平衡主要是通过ADH来完成,增高的ADH作用于肾集合管主细胞,增加水的重吸收,排出较少量的高渗尿。肾脏集合管细胞上的水通道蛋2(aquaprin-2,AQP-2)是ADH作用于肾脏调节水重吸收作用的最关键的靶蛋白。AQP-2通过穿梭机制使得主细胞对水的重吸收大大增加。慢性限水过程中,AQP-2在肾脏表达增加。生理情况可有少量AQP-2蛋白分子脱落并随尿液排出体外,并与AQP-2在肾脏表达量呈正相关。我们于体外人KC培养的情况下,添加Th2,Th1型细胞因子模拟AD患者急、慢性皮损免疫异常的模式,采用荧光实时定量PCR及Western Blot方法检测KC中FLG及其代谢相关酶类的表达变化情况,从而为揭示AD患者表皮屏障功能障碍的发生机制提供理论依据,也为将来针对AD皮损进行屏障功能调节治疗提供思路。同时通过ELISA方法检测AD患儿尿液AQP-2(u-AQP-2)水平的变化,探讨u-AQP-2水平与AD疾病严重程度的相关性,为评价儿童AD严重度寻找新的临床评价指标。　　 材料与方法：　　 一、研究对象：　　 1、人KC细胞:包括无血清培养的人皮肤角质形成细胞(Normal human keratinocytes,NHK)及HaCaT角质形成细胞株。　　 2、儿童AD病例组:50例AD患者均为辽宁籍汉族儿童,年龄2月-8岁。男35名,女15名。符合H-R诊断标准。采用客观特应性皮炎评分指数(Objective Scoring AtopicDermatitis index,O-SCORAD)确定疾病的严重程度,于就诊前3个月未系统使用糖皮质激素及免疫抑制剂,就诊前2周未使用外用药。　　 3、儿童正常对照组:35例健康儿童,年龄性别与病例组相匹配。已排除有过敏性哮喘、过敏性鼻炎及荨麻疹、湿疹、枯草热等特应性疾病及家族史的辽宁籍汉族正常儿童。以上两组研究对象均已排除其他影响水盐代谢疾病及状态,签署知情同意书。　　 二、实验材料：角质形成细胞及培养液等相关试剂、实时定量RT-PCR试剂、Western Blot相关试剂、免疫组织化学及ELISA相关试剂。　　 三、实验方法：　　 1、人KC培养方法　　 (1).NHK无血清培养方法:采用胰蛋白酶-EDTA,冷温两步消化法对人包皮皮肤组织进行消化分离,进而进行NHK细胞无血清培养,绘制生长曲线,用广谱单克隆抗角蛋白抗体免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)方法进行鉴定。　　 (2).HaCaT角质形成细胞株培养方法:按常规贴壁细胞培养传代。　　 2、检测人KC在Th2型细胞因子刺激下FLG及其代谢相关酶类在不同钙离子浓度条件培养下的表达。　　 (1)、应用实时定量RT-PCR方法检测KC在IL-4,IL-13刺激下FLG及其代谢相关酶类Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5mRNA的表达。　　 (2)、应用Western-blot方法检测KC在IL-4,IL-13刺激下FLG及其代谢相关酶类Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5蛋白水平的表达。　　 3、检测人KC在Th1型细胞因子刺激下FLG及其代谢相关酶类在不同钙离子浓度条件培养下的表达。　　 (1)、应用实时定量RT-PCR方法检测KC在IFN-γ刺激下FLG及其代谢相关酶类Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5 mRNA的表达。　　 (2)、应用Western-blot方法检测KC细胞在IFN-γ刺激下FLG及其代谢相关酶类Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5蛋白的表达。　　 4、检测儿童特应性皮炎患者尿液中AQP-2水平,评价其与O-SCORAD评分及血液,尿液临床指标的关系。　　 (1)、收集儿童AD患者病例,采用O-SCORAD评分评估严重度。　　 (2)、对患儿进行尿液pH(urine pH,u-pH),尿液比重(urine specificgravity,u-SC)及外周血嗜酸性粒细胞计数(Peripheral blood eosinophilcount,EOS),血清总IgE水平的检测(Serum Imunoglobul in E,s-IgE)。　　 (3)、ELISA方法对患儿及正常儿童尿液u-AQP-2水平进行检测,同时检测尿液肌酐水平(Creatinine,Cr)进行校正。　　 四、统计学方法：统计学分析过程采用SPSS13.0软件完成。计量资料采用-x±SD表示。Kolmogorov-Smirnov test法检验数据分布的正态性,Levenes Test检验各组间方差齐性。统计方法主要包括One-Way ANOVA分析,Students t-test,Kruskal-Wallis检验,Mann-Whitney U检验,Pearsons test/Spearmansrank test。P＜0.05具有统计学意义。　　 结果　　 1、Th2型细胞因子对人KC细胞FLG表达代谢的影响　　 (1)IL-4及IL-13能显著下调KC细胞FLG、SPINK5/LEKTI表达(P＜0.05);上调Matriptase,CAP1,KLK7表达(P＜0.05)。　　 (2)增高钙离子浓度诱导KC分化可显著上调KC细胞FLG,SPINK5/LEKTI,matriptase,CAP1,KLK7及KLK5表达(P＜0.05)。　　 2、Th1型细胞因子对人KC细胞FLG表达代谢的影响IFN-γ显著上调KC细胞FL6、SPINK5/LEKTI,Caspase14的表达(P＜0.05);显著下调Matriptase,CAP1,KLK7表达(P＜0.05)。　　 3、儿童AD尿液AQP-2的水平及其与O-SCORAD评分,临床相关指标的相关性婴儿期AD患儿u-AQP-2水平明显增高且与皮肤干燥正相关。而O-SCORAD评分,EOS,s-IgE,u-SG以及性别与儿童AD u-AQP-2水平没有相关性。　　 结论：　　 1、角质形成细胞中FLG及FLG代谢相关酶类的表达,受Th2,Th1型细胞因子的不同方向调控。Th2及Th1型免疫反应可能是通过FLG代谢相关酶类及酶抑制剂间的网络调控系统影响特应性皮炎皮损中FLG的表达,参与皮肤屏障损伤的发生。　　 2、婴儿期特应性皮炎患儿尿液AQP-2显著增高并与皮肤干燥相关。检测尿液AQP-2可能有助于指导特应性皮炎患儿补水及皮肤保湿治疗。