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研究背景:奥沙利铂是第三代铂类抗癌药,临床疗效好,应用广泛,不良反应少。奥沙利铂在卵巢癌、胃癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等实体瘤的治疗中取得不错的疗效[1]。奥沙利铂最严重的不良反应为周围神经毒性,一种是输注后几小时出现的急性感觉神经病变,另一种常常发生在输注奥沙利铂几个周期之后的累积性神经毒性[2,3]。目前研究认为奥沙利铂诱导的周围神经病理性疼痛的机制,首先为电压门控离子通道功能的改变导致神经元轴突变性;其次为氧化应激导致神经元或胶质细胞功能紊乱;再次是MAPK家族的异常表达[4,5]。尽管研究奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛机制不断有新发现,但其具体机制仍不明确,而且临床治疗效果欠佳,因此,迫切需要我们进一步深入探讨其分子机制。本实验利用奥沙利铂诱导的周围神经病理性疼痛大鼠模型,发现在模型背根神经节（Dorsal Root Ganglion DRG）神经元细胞中电压门控钠离子通道1.6（Nav1.6）高表达,因此探讨Nav1.6及其上游调控机制,为治疗奥沙利铂诱导的周围神经病理性疼痛提供新的方向和靶点。研究目的:本研究探讨奥沙利铂神经毒性引起的相关神经元兴奋性增加的分子机制,为临床治疗奥沙利铂诱导的周围神经病理性疼痛提供理论依据。研究方法:1.建立奥沙利铂诱导的周围神经病理性疼痛SD大鼠模型。模拟临床用药时间点,每周2次,共9次,给予SD大鼠腹腔注射不同剂量的奥沙利铂建立动物模型,期间应用Von-frey纤维丝检测大鼠的机械缩足阈值,热辐射仪检测热缩足潜伏时间,冷板试验检测冷缩足潜伏时间。2.检测大鼠DRG中的Nav1.6的表达和miR-30b的分布。在注药后第30天,取大鼠L4L6 DRG,应用qRT-PCR检测Nav1.6的mRNA的表达变化,Western-blot检测Nav1.6的蛋白水平变化。免疫荧光技术检测Nav1.6在大鼠不同大小DRG神经元中的分布情况,原位杂交技术检测miR-30b在不同大小DRG神经元中的分布情况及与Nav1.6的共定位情况。3.使用PC12细胞验证miR-30b与SCN8A的调控关系。构建含有SCN8A 3’UTR区的双荧光素酶质粒,在PC12细胞中转染不同剂量的miR-30b类似物和野生型质粒,检测各组荧光信号强度的变化,确定两者是否存在靶标关系。4.大鼠原代DRG细胞培养中探讨miR-30b与Nav1.6的调控关系。在原代DRG细胞中给予奥沙利铂刺激并转染mi R-30b的类似物,检测miR-30b与Nav1.6的表达水平。此外,在正常大鼠原代DRG细胞转染miR-30b的抑制剂,检测Navl.6的表达水平。5.鞘内注射miR-30b是否可以缓解奥沙利铂诱导周围神经病理性疼痛。在奥沙利铂注射后第15天给予模型大鼠鞘内注射miR-30b的类似物,连续注药4 d,检测大鼠行为学变化,同时检测DRG中miR-30b和Nav1.6的表达变化。其次给予正常大鼠鞘内注射miR-30b抑制剂,连续注药4 d,检测大鼠行为学变化并检测Navl.6的mRNA和蛋白的变化情况。6.在LS-174t细胞转染miR-30b检测细胞的增殖变化。为探讨miR-30b对结肠癌细胞增值情况的影响,在LS-174t细胞中分别转染miR-30b类似物、抑制剂,检测该肿瘤细胞的增殖变化,同时检测肿瘤细胞中Caspase-3蛋白变化。研究结果:1.奥沙利铂能够诱导SD大鼠出现神经病理性痛。模型建立后,检测其机械阈值、冷觉阈值、热痛阈的变化,发现从注药后第8天开始,机械阈值和冷觉阈值均减低,11 d降到最低值,并且2.4 mg/kg组与3.2 mg/kg组之间的阈值变化无差异（P>0.05）,但是4.0 mg/kg组机械阈值和冷觉阈值较2.4 mg/kg组和3.2 mg/kg更低（P<0.05）,差异有统计学意义。注射奥沙利铂后,大鼠的热觉阈值无明显变化。注射奥沙利铂后大鼠的体重比control组增加缓慢,差异无统计学意义。2.奥沙利铂模型大鼠DRG中Nav1.6的表达增加。取第30天不同剂量的奥沙利铂动物模型的L4L6 DRG组织,检测Nav1.6的mRNA和蛋白表达,发现注射奥沙利铂后Nav1.6的mRNA和蛋白的表达较control组均增加（P<0.001）,随着奥沙利铂剂量的累积Nav1.6的mRNA和蛋白的表达也增加,4.0mg组较2.4mg组和3.2mg组增加（P<0.05）。取8、15、22 d的模型大鼠DRG组织,发现与注射奥沙利铂前相比,注射奥沙利铂后Nav1.6的mRNA和蛋白的表达均增高,差异具有统计学意义,与第8天相比第15天、第22天大鼠Nav1.6的mRNA和蛋白的表达明显增高,但是第15天和第22天之间无明显的差异。取30 d大鼠DRG组织,行免疫荧光染色,结果表明Nav1.6与CGRP、IB4、NF-200共标,与胶质细胞不共标。3.双荧光素酶报告基因方法检测miR-30b与SCN8A存在靶标关系。Target Scan Human71预测结果表明miR-30b与SCN8A存在碱基互补序列。在PC12细胞中转染不同剂量的miR-30b agomir 10pM,50pM,100pM检测荧光素酶活性的变化。miR-30b agomir能够抑制荧光素酶活性,存在剂量依赖性,而其他组别的荧光素酶活性无改变,提示miR-30b agomir具有序列特异性,表明miR-30b与SCN8A的3’UTR区存在靶标关系。4.注射奥沙利铂后能够引起miR-30b的表达降低。注射奥沙利铂后8、15、22 d后,取大鼠L4L6 DRG组织,结果发现在miR-30b从8 d开始降低（P<0.05）,同时在15、22 d天表达均减低,与对照组相比,有统计学差异。原位杂交结果显示:miR-30b和CGRP、IB4、NF-200共标,同时也与Nav1.6共标。5.在原代DRG细胞中miR-30b抑制剂能够抑制Nav1.6的表达。奥沙利铂刺激大鼠原代DRG细胞后,其Nav1.6的mRNA和蛋白的表达水平均增加,而miR-30b表达降低。在原代DRG细胞中过表达miR-30b能够逆转奥沙利铂诱导的Navl.6的mRNA和蛋白的高表达。另外,在正常细胞转染miR-30b的抑制剂,抑制miR-30b的表达,结果显示Nav1.6的mRNA和蛋白均表达升高。鞘内注射miR-30b类似物可以缓解奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛。在奥沙利铂注射后第15天,鞘内给予miR-30的类似物,连续4天,注药第2 d开始,机械阈值和冷觉阈值明显升高,疼痛缓解,同时miR-30b类似物可以逆转Nav1.6的高表达。在正常大鼠鞘内注射miR-30b抑制剂,大鼠的机械阈值和冷觉阈值明显减低,同时发现Nav1.6的mRNA和蛋白的表达升高。6.miR-30b类似物可以抑制LS-174t细胞的增殖。在LS-174t细胞中转染miR-30b agomir发现细胞的OD值较对照组明显降低,同时发现细胞中的Caspase-3的表达增加,表明miR-30b能够抑制其细胞的增殖。而在LS-174t细胞中转染miR-30b antagomir发现细胞的OD值较对照组增加,发现细胞中的Caspase-3表达降低,表明miR-30b antagomir能够促进LS-174t细胞的增殖。研究结论:在奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛模型中,miR-30b可以通过降低Nav1.6的表达缓解疼痛,mi R-30b可能成为缓解奥沙利铂诱导的周围神经病理性疼痛的新的作用靶点。