背景：虽然冠心病的治疗手段已经取得了飞速的进展，但缺血性心脏病仍然是首位致死疾病。早期开通血管，减少缺血所致的心肌损伤和减少心肌梗死面积是目前治疗的重要目标。但是再灌注本身却同样可以引起心肌组织损伤，称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。前期临床研究发现，急性心肌梗死（acute myocardialinfarction，AMI）患者即使成功实现冠状动脉再通，恢复血流，仍有约10-15%患者发生死亡，考虑与I/R损伤有关。因此研究心脏I/R损伤的机制及防治策略具有重要临床意义。糖尿病是冠心病的独立危险因素，能够显著增加其发病率及死亡率。临床流行病学资料显示：超过75%的糖尿病患者合并冠心病，其中近50%死于AMI。并且，糖尿病患者的心血管预后明显差于非糖尿病患者。前期研究提示糖尿病加重冠心病的机制可以与高糖增加心肌I/R损伤有关。虽然目前已经发现糖尿病能够加重心肌组织微循环障碍，导致能量代谢紊乱、增高局部炎症反应，但糖尿病加重心脏I/R损伤的具体机制仍未完全阐明。Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过调节下游信号分子活性介导生存信号，在不同组织中发挥多种生物学功能。Akt信号通路在能量代谢、细胞存活、氧化应激等方面发挥重要调节作用。前期研究证实短期活化Akt能够减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡，提示Akt可能是糖尿病加重心脏I/R损伤的重要信号分子。因此，明确导致Akt活性下降的具体机制对于寻找糖尿病合并心脏I/R损伤的治疗靶点具有重要意义。磷酸肌醇（Inositol phosphates）家族广泛存在于生物体内，发挥各种重要的生物学效应。随着研究深入，对磷酸肌醇的认识逐渐加深。其中肌醇六磷酸（IP6）在肌醇六磷酸激酶（IP6Ks）催化下生产IP7。研究证实：在哺乳动物，IP7调节包括凋亡、胰岛素分泌在内的多种生理功能。最近，Snyder发现IP6k1基因敲除可以增加Akt活性，证实IP7是Akt信号通路生理性抑制剂。那么，IP7是否通过抑制Akt信号通路参与了糖尿病加重心脏I/R损伤的病理过程呢？ IP6K/IP7是否可以成为糖尿病合并心脏I/R损伤的潜在治疗靶点？本研究拟通过在体及离体实验探讨IP6Ks/IP7在糖尿病合并心脏I/R损伤中的作用及其机制。目的：1.在体及离体明确糖尿病是否加重心脏I/R损伤以及Akt活性的变化；2.细胞水平阐明高糖加重心肌细胞I/R损伤的分子机制，即IP7/Akt/GSK3β信号通路在其中的作用；3.在体水平进一步验证干预IP7/Akt/GSK3β信号通路对糖尿病合并心脏I/R损伤的保护作用；方法：1.采用高糖高脂饲料喂养联合（streptozocin，STZ）腹腔注射的方法构建糖尿病大鼠模型。STZ（50mg/kg），连续腹腔注射5d后血糖仪检测血糖。连续空腹血糖>11mmol/L认为糖尿病模型造模成功，用于后续实验；2.开胸结扎大鼠冠状动脉左前降支（LAD）构建心脏I/R模型。缺血30min后放松结扎线给予再灌注3h，再灌注前2h静脉给予IP6Ks抑制剂TNP下调心肌组织中IP7生成；3. Evans蓝/TTC双染法测定I/R损伤导致的心肌梗死面积；4.采用TUNEL染色及Caspase-3活性检测的方法观察心肌组织及心肌细胞的凋亡；5.采用心脏超声记录各组大鼠左心室舒张末期容积（LVEDV）及左心室收缩末期容积（LVESV）。进一步计算左室射血分数（LVEF）以及短轴缩短率（FS）。6.酶消化法分离乳鼠心肌细胞，高糖（25mM葡萄糖）培养模拟在体糖尿病水平，建立缺氧/复氧（H/R）损伤模拟在体I/R损伤，并给予IP6Ks抑制剂TNP下调IP7生成；7. MTT法检测心肌细胞活力；HPLC检测心肌细胞中IP7含量；8. Western Blot检测心肌细胞及心肌组织中Akt, p-Akt (Ser473、T308), GSK-3β、pGSK-3β、NF-κB、pNF-κB表达水平；结果：1.高糖高脂饲料喂养联合STZ腹腔注射后，血糖水平逐渐增高而胰岛素水平逐渐降低，到第14d趋于稳定，并出现多饮、多食、多尿等症状，提示大鼠糖尿病模型构建成功；2.与正常血糖大鼠相比，糖尿病大鼠发生I/R损伤后，心肌梗死面积增加；心肌组织TUNEL阳性细胞及Caspase-3活性进一步增高，表明糖尿病增加I/R损伤后心肌组织细胞凋亡。与正常大鼠相比，糖尿病大鼠发生I/R损伤后，LVEF及FS均显著下降，提示糖尿病进一步加重I/R损伤及降低心脏收缩功能；3. TUNEL及Caspase-3活性检测结果显示：高糖培养不增加常氧条件下心肌细胞凋亡，但增加H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡；4. Western Blot结果显示：高糖减少心肌细胞磷酸化Akt表达水平，并进一步减少H/R损伤后心肌细胞Akt活性。HPLC检测提示高糖显著增加H/R损伤后心肌细胞中IP7生成；5.通过观察不同浓度TNP对心肌细胞凋亡及Akt活性的影响筛选最佳TNP干预浓度。发现10.0μM TNP增加Akt活性、减少细胞凋亡的效果最显著，因此在后续细胞实验中采用该浓度TNP进行干预；6. TNP（10.0μM）显著减少高糖联合H/R损伤后心肌细胞中IP7生成，增加Akt活性，提高细胞活力并减少凋亡。提示TNP（10.0μM）显著减少高糖联合H/R损伤后心肌细胞；7.通过观察不同剂量TNP对糖尿病大鼠心肌组织Akt活性的影响，筛选最佳TNP干预剂量。Western blot结果显示糖尿病大鼠心肌组织中pT308Akt和pS473Akt表达水平均显著低于正常大鼠。给予TNP预处理后，糖尿病心肌组织中Akt磷酸化水平随着TNP浓度增加逐渐增高。在浓度为20μg/kg时， TNP增加Akt活性的效果最显著，因此在后续细胞实验中采用该浓度TNP进行干预；8. TNP（20μg/kg）预处理显著减少糖尿病联合I/R损伤后心肌梗死面积及心肌细胞凋亡，改善心脏收缩功能。结论：1.糖尿病增加心脏I/R损伤，其机制可能与高糖增加心肌细胞对I/R的易损性有关；2.高糖条件下，TNP预处理可以通过减少IP7生成，恢复Akt活性，从而对心肌细胞的H/R损伤起到保护作用；3.通过抑制IP6Ks活性调节IP7水平可以恢复糖尿病心肌组织Akt信号活性，从而对心脏I/R损伤起到保护作用。