口服疫苗能够刺激全身和黏膜水平的体液和细胞免疫反应,具有成本低、给药方便等优势。乳酸菌是食品级的益生菌,能以活菌的形式到达肠道并在其表面定植,可以作为口服疫苗递送的载体,在稳定表达外源抗原的同时发挥其益生功能。因此开发乳酸菌基因工程口服疫苗对新型疫苗的研发具有重要意义。新型冠状病毒（SARS-Co V-2）是一种新发的具有高传染性和高致病性的呼吸道病毒,研发新型疫苗以控制病毒传播和感染是十分重要的。猪流感是猪最重要的呼吸道疾病之一,接种疫苗是防控流感病毒感染的主要策略。诱导黏膜免疫反应的口服疫苗有开发为预防新型冠状病毒和流感病毒感染的新型疫苗的潜力。本研究分析了鼠李糖乳杆菌LR16的体内外生物学特性,并以其为乳酸菌基因工程疫苗载体,构建表达新型冠状病毒RBD和表达H1N1型流感病毒HA的重组乳酸菌,进行免疫效力的初步研究。具体研究结果如下:1.鼠李糖乳杆菌LR16的体内外生物学特性研究首先,本研究分析了本实验室保存的鼠李糖乳杆菌LR16的体内外生物学特性。发现其体外生长增殖速度快,易大量培养。评价LR16的抗逆性和益生特性,发现LR16在p H3～9时,仍有60%以上的存活率,在0.1%胆盐时部分存活,耐受1%胰酶和55℃热处理,有一定的抑菌效果,表明LR16具有一定的耐酸碱、耐胆盐、耐胰酶、耐热的抗逆性和益生特性。为分析LR16的肠道驻留特性,通过RT-PCR定量分析LR16-GFP重组菌在小鼠肠道的分布、驻留,发现重组菌能在小鼠回肠、盲肠和结肠驻留72h以上,具有较好的肠道定植能力。结果表明,LR16可以作为定植肠道以递送外源蛋白的乳酸菌基因工程疫苗载体。2.表达新型冠状病毒RBD2重组乳酸菌的构建及免疫效力的初步研究为分析LR16菌株能否作为新型冠状病毒主要抗原S蛋白RBD的递送载体。本研究将RBD二聚体分别和CTA1-DD、DCpep、Fc和CTB串联,并定向插入到LR16基因组。通过PCR鉴定和测序,确定四种重组乳酸菌构建成功。为初步研究其免疫保护效果,将小鼠分为灌胃组和自由采食组。4周后14d,在P4实验室用10~3LD50的SARS-Co V-2（中国科学院病毒研究所,IVCAS 6.7512）感染小鼠,通过RT-PCR检测感染小鼠肺部的病毒载量。发现灌胃组中,LR16-RBD2-CTA1-DD组病毒载量显著低于PBS对照组和LR16对照组（P＜0.01）;LR16-RBD2-DCpep组病毒载量也显著低于PBS对照组和LR16对照组（P＜0.05）;而LR16-RBD2-Fc组和LR16-RBD2-CTB组的病毒载量与LR16对照组无显著差异（P＞0.05）。在自由采食组中LR16-RBD2-CTA1-DD组的病毒载量也低于LR16对照组,但差异不显著（P＞0.05）。结果表明,四种表达新型冠状病毒RBD2的重组乳酸菌中,LR16-RBD2-CTA1-DD重组菌降低小鼠肺部病毒载量的效果最显著,有开发为新型冠状病毒口服疫苗的潜力。3.表达H1N1型流感病毒HA重组乳酸菌的构建及免疫效力的初步研究为分析LR16菌株能否作为H1N1型流感病毒HA的递送载体,本研究将HA1、HA2分别和CTA1-DD佐剂串联,并定向插入到LR16基因组,通过PCR鉴定和测序,确定两种重组乳酸菌构建成功。为初步研究其免疫保护效果,每周给小鼠灌胃,连续4周。灌胃4周后7d,通过间接ELISA检测小鼠血清中抗体滴度。发现LR16-HA1-CTA1-DD组小鼠产生的Ig G抗体水平显著高于LR16对照组（P＜0.01）。灌胃4周后14d,用10~3 LD50的A/WSN/1933（H1N1）毒株感染小鼠。感染后3d,LR16对照组和LR16-HA2-CTA1-DD组体重明显下降。LR16对照组存活率为40%;LR16-HA2-CTA1-DD组小鼠全部死亡;LR16-HA1-CTA1-DD组存活率为90%。结果表明,LR16-HA1-CTA1-DD重组菌对小鼠抵抗WSN感染具有一定的免疫保护效果。因此分析了LR16-HA1-CTA1-DD重组菌的体外生物学特性和遗传稳定性,发现其体外生长增殖快,具有一定的耐酸碱、耐胆盐、耐胰酶和耐热的抗逆性,且遗传稳定性较好。综上所述,本文分析了LR16的体外生长特性,抗逆性、益生特性和肠道驻留能力,发现其具有作为口服疫苗益生菌载体的特性。本研究构建的表达新型冠状病毒RBD2和表达H1N1型流感病毒HA重组乳酸菌对小鼠有一定的免疫保护效果,重组鼠李糖乳杆菌具有开发为乳酸菌基因工程口服疫苗的潜力。