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目的:研究蒿本内酯对前列腺癌相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblasts,CAFs)的选择性促凋亡效应、对CAFs作用于T细胞的免疫抑制效应的抑制及上述两方面效应的相关分子机制。方法:在蒿本内酯的促凋亡效应研究中,选用人前列腺癌相关成纤维细胞作为研究对象,采用人前列腺正常成纤维细胞(Normal Fibroblasts,NFs)作为对照组,采用MTT法检测细胞增殖情况;采用流式细胞术和免疫组化检测蒿本内酯作用于CAFs后的细胞凋亡及细胞周期的改变;采用Western blot及qPCR检测蒿本内酯作用于CAFs后凋亡相关蛋白的表达变化。构建C57BL/6小鼠皮下前列腺癌移植瘤模型,每组8只小鼠,前列腺癌细胞系为RM-1,接种密度为5×10~5/只小鼠,荷瘤第2天后腹腔注射蒿本内酯,剂量为5mg/kg体重,隔日记录肿瘤体积,第18天终止实验,并取肿瘤组织拍照。在蒿本内酯抑制CAFs对T细胞的免疫抑制效应的研究中,采用MTT法测定蒿本内酯对CAFs及脾细胞生长情况的影响;采用流式细胞术检测蒿本内酯是否恢复T细胞的增殖;采用Western Blot及实时定量荧光PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测蒿本内酯作用CAFs后相关蛋白及mRNA的水平;采用酶联免疫吸附试验检测蒿本内酯作用CAFs后的上清刺激T细胞IFN-γ的表达水平;采用免疫组织化学检测体内及体外实验中蒿本内酯作用CAFs后α-SMA的表达水平。结果:在选择性促凋亡实验中,MTT结果显示蒿本内酯对CAFs有明显的抑制作用。流式细胞学结果显示蒿本内酯可诱导CAFs发生凋亡,且呈现剂量-效应关系。组化染色结果显示蒿本内酯处理后,细胞色素C(Cytochrome C)阳性的CAFs细胞比例增加,且呈现剂量-效应关系。Western Blot结果显示,蒿本内酯处理CAFs后,内源性凋亡相关蛋白明显变化,且呈现时间依赖关系。细胞周期的流式细胞学检测结果显示,蒿本内酯处理的CAFs发生细胞周期G2-M期阻滞,Western Blot结果显示,P53蛋白下调,p-P53、P21、Cyclin B1和Cyclin D1上调。采用TLR4阻断剂CLI-095后,早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均有所下降,组化染色结果与之一致,qPCR结果显示,与蒿本内酯处理组相比,TLR4阻断后,蒿本内酯处理CAFs后,CAFs的Bax转录水平有所下降,而Bcl-2转录水平有所回升。Western Blot结果显示,TLR4阻断后,Caspase9表达水平有所回升,Cleaved Caspase9有所下降,Bax不再增加,p-P53依然呈上升趋势,Cytochrome C不再上升。流式细胞学检测显示,TLR4阻断后,CAFs的细胞周期不再阻滞于G2/M期。采用Caspase广谱阻断剂Z-VAD-FMK后,蒿本内酯诱导的CAFs早期凋亡减少,组化结果与之一致,而Caspase阻断后,细胞周期的流式分析结果显示蒿本内酯处理CAFs后,CAFs依然阻滞于G2/M期。在抑制CAFs免疫抑制功能的研究中发现,一定浓度范围内蒿本内酯对脾细胞生长无影响,但其可以恢复被CAFs上清抑制的T细胞增殖,同时蒿本内酯处理后CAFs后会激活相关信号通路蛋白表达水平改变,包括MyD88、TRAF6、p-P65等。采用TLR4阻断剂后蒿本内酯不再抑制CAFs的免疫抑制功能,并且阻断剂预处理之后CAFs的NF-κB信号通路未被激活。蒿本内酯通过TLR4下调CAFs的α-SMA表达水平。同时在体内实验中发现蒿本内酯能明显下调前列腺癌组织中α-SMA的表达。qPCR实验发现蒿本内酯通过TLR4下调CAFs的IL-10的表达水平。在T细胞增殖实验中发现在蒿本内酯处理之后的CAFs上清中加入IL-10能明显抑制T细胞增殖。同时在酶联免疫吸附实验中发现CAFs上清能明显抑制T细胞分泌IFN-γ,蒿本内酯处理之后的CAFs上清能恢复T细胞分泌IFN-γ,而使用TLR4阻断剂预处理或加入IL-10后蒿本内酯不再恢复T细胞分泌IFN-γ。结论:蒿本内酯可能通过阻滞CAFs细胞周期和诱导CAFs内源性凋亡抑制前列腺癌CAFs的增殖。蒿本内酯通过TLR4下调CAFs的IL-10的表达水平从而改变前列腺癌CAFs的免疫抑制功能,恢复被CAFs上清抑制的T细胞增殖和恢复T细胞IFN-γ的表达。蒿本内酯有望成为抗肿瘤新药候选分子。