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H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)可导致禽类较高的发病率和死亡率,给世界养禽业带来了巨大的经济损失。该病在全球多地呈地方流行性,还可出现感染人的现象,因此给人类生命健康带来巨大的威胁。目前,H5N1亚型AIV的HA蛋白头部糖基化位点变化日益增大,糖基化组合模式日益复杂化,这使H5N1亚型的AIV的流行趋势变得更加多样化,同时也增加了疫苗的防控难度。本实验室前期研究表明,HA蛋白头部158或169位糖基化位点缺失后可使H5N1亚型AIV对哺乳动物的易感性和致病性显著增强。“细胞因子风暴”的爆发是H5N1亚型AIV产生高致病性的主要原因。树突状细胞(DCs)除了作为专职的抗原递呈细胞,近年来该细胞在调控宿主天然免疫应答方面也具有主导作用,在AIV诱导的“细胞因子风暴”中可能发挥重要作用但具体作用机制尚不明确。本研究首先在体外成功诱导培养了小鼠骨髓源DCs,其次评估了 HA蛋白不同糖基化修饰的H5N1亚型AIV(rS-WT、rS△158和rS△169)对DCs天然免疫水平的影响,最后进一步阐明分析糖基化位点的改变对DCs表面C型凝集素受体识别AIV能力的影响,本研究为解析H5N1高致病性AIV对哺乳动物的致病机理提供一定的理论依据。1、小鼠骨髓源树突状细胞的体外诱导培养及鉴定分离小鼠骨髓前体细胞,应用细胞因子GM-CSF和IL-4联合诱导培养,至其分化为DCs,应用流式细胞术和激光共聚焦显微镜对DCs的形态学、纯度和成熟功能进行鉴定,结果显示,培养细胞具有典型树突形态,纯度可达90%以上(CD11c+),在LPS刺激下可转变为成熟状态,以上结果表明,诱导培养的细胞符合DCs的典型特征,可用于开展后续试验。2、158位或169位糖基化位点缺失的H5N1亚型AIV对小鼠DCs天然免疫应答的影响首先,应用绝对qRT-PCR测定野生型病毒(rS-WT)、158位或169位糖基化位点缺失毒株(rS△158/rS△169)三株重组AIV对DCs的感染能力,结果显示各AIVs对DCs的感染能力有限;其次发现,与rS-WT相比,rS△158/rS△169可显著增加DCs的形态指数;显著促进DCs,的表型标志(CD80、CD86、CD40、MHCⅡ)、早期活化标志(CD69)、迁移标志(CCR7)的表达;显著促进促炎细胞因子(IL-1p、IL-6、IL-12、TNF-α)的分泌。已感染病毒的DCs与CD4+T细胞的混合淋巴反应(MLRs)测定中发现,当病毒分别以MOI=0.1/0.5/1的剂量感染DCs,细胞比例为DCs:T=1:1/1:5时,与rS-WT组相比,rS△158/rS△169组能够组显著促进CD4+T细胞的增殖;已感染病毒的DCs吞噬FITC-Dextran的试验发现,与rS-WT组相比,rS△158病毒感染的DCs吞噬能力显著减弱。最后,各毒株滴鼻感染小鼠后发现,与rS-WT相比,rSA158/rS△169可以显著促进DCs向鼻腔黏膜上皮下方迁移及附近引流淋巴结-颈淋巴结的迁移,其主要参与的DCs亚型为CD103+。以上结果表明,与野生型毒株相比,158或169位糖基化位点缺失的H5N1亚型AIV能够显著增强小鼠DCs的天然免疫水平。3、C型凝集素受体在介导158位或169位糖基化位点缺失的重组H5N1亚型AIV增强DCs天然免疫应答水平中的作用首先,通过唾液酸受体抑制试验发现,应用唾液酸酶阻断DCs表面的α-2,3和α-2,6唾液酸受体后发现,各组AIVsNP表达量并未完全降低,表明AIVs并非完全依赖唾液酸受体途径入侵DCs;其次,通过体外EDTA和mannan抑制剂阻断试验发现;rS△158/rS△169组的NP蛋白表达量显著下降,表明C型凝集素在病毒入侵中可能发挥重要作用。进一步对各毒株感染后的DCs进行免疫荧光染色并应用激光共聚焦显微镜观察发现,与rS-WT组相比,荧光标记rSA158/rS△169病毒黏附细胞的能力增强,同时更易与SIGN-R1和MR两种C型凝集素形成共定位,但与MGL受体的共定位能力较弱;体外C型凝集素受体中和抗体阻断试验发现,SIGN-R1和MR中和抗体可以阻断rS△158/rS△169组的NP蛋白表达量上调及表型标志CD80的表达,但MGL中和抗体阻断后NP蛋白及CD80的表达未受影响,体内小鼠滴鼻攻毒试验结果显示,与rS-WT组相比,rS△158/rS△169病毒能够募集高表达SIGN-R1和MR而非MGL受体的DCs迁移至鼻腔黏膜上皮下方处。以上结果共同表明,与野生型病毒相比,158或169位糖基化位点缺失病毒,主要通过C型凝集素受体SIGN-R1和MR,而非MGL依赖途径入侵DCs,进而引起高水平的天然免疫应答。