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神经炎症是中枢神经系统的固有免疫反应,脑内主要介导这类反应的胶质细胞在受到各种病理因素的损伤或刺激时,可由静息态转变为激活态,吞噬清除变性的神经组织碎片,对神经元发挥保护作用;但是过度激活胶质细胞,导致大量的炎症因子的生成,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、活性氧(reactiveoxygen species,ROS)、白介素(interleukin,IL)和一氧化氮(nitric oxide,NO)等,导致神经元损伤,引起神经炎症。尽管对神经炎症的机制尚未完全了解,但大量研究表明,氧化应激(Oxidative stress,OS)在炎症反应中起着关键性作用。本课题以酸枣仁皂苷A作为研究对象,参考相关研究报道,从神经炎症角度出发,考察酸枣仁皂苷A的保护作用及相关机制。本研究采用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导星形胶质细胞C6建立体外神经炎症模型,研究酸枣仁皂苷A抑制星形胶质细胞活化,干预LPS诱导的C6细胞氧化应激反应的发生,并进一步研究酸枣仁皂苷A对NF-κB/Nrf2信号通路的调控,发挥抑制神经炎症发生的可能的理论依据。目的:研究酸枣仁皂苷A对LPS诱导星形胶质细胞C6神经炎症发生的保护作用,并探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测LPS和酸枣仁皂苷A处理细胞后,在不同作用时间点和不同浓度的情况下细胞存活率的变化,Griess法检测细胞内一氧化氮(NO)水平;建立神经炎症模型;Western blot法检测细胞内GFAP蛋白的表达;Elisa法检测细胞内TNF-α、IL-1β和PGE2含量变化;Western blot法检测细胞内一氧化氮合酶(inducible no synthase,iNOS)和环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达情况;qRT-PCR法检测TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2基因表达变化;通过DCFH-DA和罗丹明123荧光染色经流式细胞术检测细胞内ROS的含量和线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)的水平;微板法分别检测丙二醛(malondialdehyde;MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase;SOD)等氧化应激副产物在细胞内含量与活性;分离胞浆与细胞核蛋白,免疫荧光和Western blot法检测细胞NF-κB/p65内和Nrf2蛋白在细胞内表达位置的变化情况;Western blot法检测Nrf2信号通路下游HO-1,NQO1和GCLC蛋白表达变化。结果:1.酸枣仁皂苷A对LPS诱导的星形胶质细胞C6活化的保护作用(1)MTT实验结果表明,LPS与酸枣认皂苷A在一定时间和浓度下对C6细胞存活率有明显抑制作用,其中LPS在处理时间为24 h和浓度为1μg/mL的情况下,细胞存活率最高,而酸枣仁皂苷A则在处理时间为24 h和浓度为0.125-50μΜ的范围内对细胞生长无明显增值抑制作用;(2)Griess法检测结果显示,C6细胞在1μg/mL LPS作用下,细胞内NO水平呈时间依赖性增加(P<0.01);(3)LPS作用细胞后,与正常对照组相比,细胞内GFAP蛋白表达明显增加,诱导星形胶质细胞活化(P<0.05);而酸枣仁皂苷A预处理后,GFAP蛋白的表达呈浓度依赖性减少(P<0.01)。2.酸枣仁皂苷A对LPS诱导C6细胞氧化应激和炎症反应的影响(1)Griess法检测结果显示,与对照组比较,LPS作用后NO释放增加(P<0.05),酸枣仁皂苷A预处理之后,NO释放减少(P<0.01);(2)Elisa实验结果表明,LPS单独作用后炎症因子TNF-α、IL-1β和PGE2的表达显著增加(P<0.05),而酸枣仁皂苷A可以浓度依赖性抑制炎症因子的表达(P<0.01);(3)Western blot结果表明,与对照组比较,LPS诱导C6细胞内iNOS和COX-2蛋白表达明显增加(P<0.05),酸枣仁皂苷A预处理后,iNOS和COOX-2蛋白表达明显减少(P<0.01);(4)qRT-PCR实验结果进一步证明酸枣仁皂苷A抑制LPS诱导C6细胞炎症因子释放;(5)流式细胞术检测DCFH-DA荧光染色发现酸枣仁皂苷A有效减少LPS诱导的细胞内ROS的产生(P<0.01);(6)罗丹明123荧光染色后发现LPS单独处理后线粒体膜电位水平明显降低(P<0.05),酸枣仁皂苷A作用后,可以有效抑制线粒体膜电位的损伤(P<0.01);(7)实验结果显示,LPS作用细胞后,MDA的含量显著增加,而细胞内SOD活性和GSH含量明显减少(P<0.05);酸枣仁皂苷A预处理后,细胞内MDA的含量降低,SOD活性和GSH含量升高(P<0.01),保护细胞内氧化损伤;3.酸枣仁皂苷A抑制LPS诱导C6细胞神经炎症反应的作用机制(1)免疫荧光法观察NF-κB/p65在细胞内的表达结果显示,与对照组比较,LPS单独作用C6细胞24 h后,细胞核内NF-κB/p65荧光表达明显增强(P<0.05);酸枣仁皂苷A预处理后,细胞核内NF-κB/p65荧光表达浓度依赖性的降低(P<0.01);(2)Western blot实验结果同样表明,与对照组比较,LPS诱导C6细胞内NF-κB/p65核蛋白表达的增加,而胞浆蛋白表达减少(P<0.05),12.5-50μΜ酸枣仁皂苷A作用细胞后,NF-κB/p65核蛋白表达明显降低,胞浆蛋白表达浓度依赖性增加(P<0.01),从而抑制相关炎症因子的释放,对细胞发挥抗炎作用;(3)免疫荧光实验结果显示,LPS作用细胞后,细胞核内Nrf2的荧光强度增加;12.5-50μΜ酸枣仁皂苷A作用细胞后,细胞核内Nrf2的荧光强度浓度依赖性增加(P<0.01);(4)Western blot实验结果同样显示,酸枣仁皂苷A促进Nrf2进入细胞核,诱导下游相关抗氧化酶表达,保护细胞氧化损伤;(5)Western blot实验结果显示,与对照组比较,LPS作用细胞24 h后,细胞内HO-1,NQO1和GCLC的蛋白表达明显增加(P<0.05),酸枣仁皂苷A预处理后,各蛋白含量浓度依赖性增加(P<0.01),提示酸枣仁皂苷A通过上调Nrf2/HO-1信号通路发挥抗氧化作用。结论:研究结果表明,LPS上调星形胶质细胞标志蛋白GFAP表达,诱导星形胶质细胞C6活化,刺激细胞内活性氧和MDA含量增加,以及线粒体膜电位和相关抗氧化酶GSH含量和SOD活性降低,并且诱导NO,TNF-α、IL-1β、PGE2、iNOS和COX-2等炎症因子释放增加,导致细胞神经炎症的发生。酸枣仁皂苷A通过促进Nrf2进入细胞核并激活其信号通路下游相关蛋白HO-1,NQO1和GCLC,降低细胞核内NF-κB/p65表达,对细胞发挥抗炎抗氧化的神经保护作用。