原核移植在生殖研究领域中具有巨大的应用前景。通过原核移植将不同来源的原核与胞浆重构为核-浆异质胚胎，可以为探讨胚胎发育过程中核质互作机制、分析雌雄遗传物质作用、防治母源性线粒体遗传病等提供研究模型。大量动物实验的成功经验可为人类胚胎原核移植提供参考。但由于人与动物的种系差异，能供参考的资料有限，人类原核移植胚胎模型的构建以及应用仍需要大量的基础研究。目前受伦理道德法律、人类卵子/胚胎资源有限等限制，人原核移植研究进展缓慢。多原核合子(多原核受精卵)是临床治疗中的“废弃”胚胎，用于科学研究可以避免伦理法律约束。 目前胚胎冷冻技术己经在人类辅助生殖领域中发挥了重要的作用。利用冷冻技术，人们可以有效地长期保存卵子、胚胎、卵巢组织等各种标本并建立细胞库。不但可以克服时间与空间的限制，节省人力物力，还避免资源浪费，便于各项科学研究。常用的冷冻技术包括程序化慢速冷冻与玻璃化冷冻。程序化慢速冷冻在各生殖中心常规使用，但是这种方法程序繁琐，耗时长，需要配备昂贵的降温设备。玻璃化冷冻在近年来逐渐受到人们的关注，相对于程序化慢速冷冻，具有简单快速、经济、胚胎复苏率高的优点。自1998年Mukaida等首次成功应用玻璃化冷冻人类胚胎并移植获得妊娠，目前己有较多不同发育阶段的玻璃化冷冻胚胎妊娠成功的报道，有逐渐取代慢速冷冻的趋势。 临床上的多原核受精卵为原核移植基础研究提供了理想的材料来源。但是，多原核受精卵资源同样有限，而且提供原核与胞浆的多原核受精卵通常无法同时获得。因此，能否将平时收集到的多原核受精卵妥善保存起来以供随时所需成为目前有待解决的问题。本研究以玻璃化冷冻方法保存多原核受精卵并对其在原核移植中的应用潜能进行初步研究。【目的】 通过新鲜多原核受精卵与玻璃化冻融多原核受精卵之间的原核移植，探讨冻融后的原核及胞浆用于重构原核期胚胎的可行性，以及比较不同重构胚胎的发育潜能。从而为解决原核供者与胞浆供者在取卵时间上的同期配合难题提供可行途径，充分利用临床“废弃”胚胎构建核．浆异质胚胎模型。 【方法】 1、在受精后16-20小时，观察胚胎的原核形成与极体排出情况，含有3个或以上原核+2个极体者记录为多原核受精卵。经患者签署知情同意书后，选择透明带完整以及原核清晰的多原核受精卵纳入实验中。 2、实验分组： (1)新鲜原核移植组。由新鲜多原核受精卵之间相互原核置换的重构胚胎。 (2)新鲜原核．冻融胞浆原核移植组。由新鲜原核与玻璃化冻融胞浆重构的胚胎。 (3)冻融原核．新鲜胞浆原核移植组。由玻璃化冻融原核与新鲜胞浆重构的胚胎。 (4)玻璃化冻融多原核胚胎组． (5)新鲜多原核胚胎对照组。 (6)新鲜多原核胚胎去多余原核操作对照组。 3、对多原核受精卵进行玻璃化冷冻解冻、原核移植(电融合法)、去除多余原核操作。 4、对各组胚胎进行体外培养，观察与记录胚胎发育情况并进行形态学评分。 5、以荧光原位杂交技术对胚胎进行X、Y、18号染色体非整倍体分析。 6、结果进行统计学分析。 【结果】 1、共收集152个多原核受精卵用于本研究。 2、共冷冻多原核受精卵57个，回收56个，回收率为98.25％。复苏51个，复苏率为90.38％。28个冷冻复苏的多原核受精卵(V-3PN)与新鲜多原核受精卵(3PN)进行发育形态学比较，两组的卵裂率、4-细胞率、囊胚率差异无统计学意义(P>0.05)，V-3PN组的6-细胞以上率低于3PN组，差异有统计学意义(P<0.05)。 3、共对68个多原核受精卵(23个冻融与45个新鲜)进行原核移植操作，核-浆复合体重构成功62个，总操作成功率为91.18％。进行电融合62个，融合成功54个，平均融合成功率为87.10％。分别重构新鲜原核移植胚胎(FF-PNT)16个、新鲜原核．冻融胞浆胚胎(FT—PNT)17个、冻融原核．新鲜胞浆胚胎(TF-PNT)21个。三组问核．浆复合体重构率、电融合成功率差异无统计学意义(P>0.05)。对21个多原核受精卵去核操作(E-2PN)，去核存活20个，操作成功率为95.24％。 4、原核移植组胚胎发育形态学比较： 在新鲜胞浆情况下(TF-PNT VS FF-PNT&E-2PN)，TF-PNT与FF-PNT的卵裂率、4-细胞率、6-细胞以上率、Day3胚胎各分级比率相近，差异无统计学意义(P>0.05)。TF-PNT组与E-2PN组的卵裂率、4-细胞率、6-细胞以上率、Day3胚胎各分级比率差异无统计学意义(P>0.05)。 在新鲜原核情况下(FT-PNT VS FF-PNT&E-2PN)，FT-PNq、组的卵裂率、4-细胞率、6-细胞以上率低于FF-PNT组，差异无统计学意义(P>0.05)；两组的Day3胚胎各分级比率差异无统计学意义(P>0.05)。FT-PNT组的卵裂率、4-细胞率、6-细胞以上率低于E-2PN组，差异无统计学意义(P>0.05)；FT-PNT组6-细胞以上率低于E-2PN组，P值为0.022，差异有统计学意义。两组的Day3胚胎各分级比率差异无统计学意义(P>0.05)。 在FF-PNT组、FT-PNT组、TF-PNT组与E-2PN组4组中，新鲜原核．冻融胞浆组(FT-PNT)中29.4％Day2胚胎未卵裂，未卵裂率高于其余3组，P=0.439，差异有统计学意义。 5、对发育停滞超过24小时的原核移植胚胎进行Hochest33342染色。大部分卵裂球内含单个细胞核，部分卵裂球无核物质，部分卵裂球含2个或以上细胞核。成功对4个新鲜原核移植胚胎(FF-PNT)、2个新鲜原核-冻融胞浆原核移植胚胎(FT-PNT)、3个冻融原核．新鲜胞浆原核移植胚胎(TF-PNT)共9个胚胎进行了细胞固定与X、Y、18号染色体非整倍体分析。被分析的胚胎存在染色体数目异常，表现为正常嵌合型、异常嵌合型与无序分裂型。 【结论】 1.玻璃化冻融多原核受精卵可以与新鲜多原核受精卵构建核-浆异质胚胎模型。玻璃化冻融过程不影响原核移植效率。 2.以玻璃化冻融多原核受精卵为基础的原核移植重构胚胎具有卵裂能力。采用新鲜胞浆可能更有利于原核移植重构胚胎的早期发育。 3.以多原核受精卵为基础的原核移植重构胚胎囊胚形成率低。