心肌肥厚是心脏对多种疾病的适应性反应,如高血压、瓣膜病、心肌缺血等,持续的病理性刺激会引起心肌细胞在结构和电生理学上的重构,这将大大增加了心律失常和心力衰竭的风险。所以研究心肌肥厚的发生机制、有效控制心肌肥厚的发展进程对预防和治疗心肌肥厚引发的心力衰竭具有重要的价值。众多研究表明Gq通路的激活在心肌细胞肥大的过程中起到了至关重要的作用。Gq偶联受体激动剂包括血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）、去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、内皮素（endothelin,ET）可诱发新生鼠左室心肌细胞（NRVMs）肥大。在NRVMs中过表达野生型Gαq蛋白可使心肌细胞肥大,而过表达持续激活的Gαq突变体蛋白,最初引起心肌细胞肥大进而发展为心肌坏死。通过转基因方法在小鼠心脏中特异性表达Gαq蛋白,可使心脏的重量以及心肌细胞的大小都明显的增加,ANP、α-action和β-MHC等胎儿基因的表达也明显增加。迄今为止Gq通路激活引起心肌细胞肥大发生的机制尚不清楚。而Ca²⁺在心肌肥厚发生过程中的作用近年来越来越受到人们的关注。研究发现细胞内Ca²⁺浓度升高可激活细胞内的钙调磷酸酶（CaN）,进而激活活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）,从而引起肥厚相关基因的转录增加,这一通路可能在心肌肥厚的发生过程中具有重要的作用。但Gq通路激活以及过表达Gαq引发的心肌肥厚是否通过对细胞内钙信号产生影响而实现的目前还不是很清楚。本实验首先利用Adeasy腺病毒载体系统构建含小鼠野生型Gαq基因的重组腺病毒载体,再使其转染乳鼠心肌细胞,观察过表达Gαq的乳鼠心肌细胞在AngⅡ、NE作用下细胞内钙信号的变化,以研究Gq通路激活引起心肌肥厚与细胞内钙信号的关系。第一部分携带小鼠野生型Gαq基因的重组腺病毒载体的构建目的:利用Adeasy腺病毒载体系统构建含小鼠野生型Gαq基因的重组腺病毒,并在HEK293A细胞中进行重组腺病毒pAd-Gαq-GFP的扩增制备。方法:（1）目的基因pGEMHE-Gαq经PCR加入SpeⅠ和PvuⅠ两个酶切位点并大量扩增,凝胶电泳鉴定,正确PCR产物胶回收提纯。（2）PCR产物与穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1经SpeⅠ和PvuⅠ充分消化,将其产物经T4连接酶连接,构建成功的质粒pShuttle-Gαq经凝胶电泳鉴定,同时送测序公司测序。（3）经测序证实后的pShuttle-Gαq依次进行PmeⅠ线性化、纯化、去磷酸化、胶回收等处理。通过Bio-Rad电转化仪将线性化后的pShuttle-Gαq转化入BJ-5183-Adeasy感受态细胞,进行同源重组。经凝胶电泳鉴定成功的重组质粒转化入DH5α感受态细胞中扩增。（4）重组腺病毒质粒pAd-Gαq-GFP经PacⅠ线性化后,用酚-氯仿提纯质粒。纯化后的线性重组腺病毒质粒pAd-Gαq-GFP经LipofectamineTM 2000转染HEK293A细胞,包装制备腺病毒颗粒。（5）将原代病毒液反复冻融3次后,继续感染HEK293A细胞进行病毒颗粒的扩增。包装成功的病毒颗粒感染HEK293A细胞后提取全细胞蛋白经western-blot方法鉴定是否达到过表达Gq蛋白的目的。结果:（1）PCR扩增方法将SpeⅠ和PvuⅠ两个酶切位点加入Gαq cDNA两端,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,PCR产物片段长度约1kb,与预期大小1098bp相符。（2）以上PCR产物与穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1分别经SpeⅠ和PvuⅠ酶切消化,酶切产物经T4连接酶连接构成质粒pShuttle-Gαq。质粒pShuttle-Gαq中插入片段序列正确性经酶切鉴定和DNA测序证实。（3）测序证实后的质粒pShuttle-Gαq经PmeⅠ线性化后,经电转化转入携带腺病毒骨架pAdeasy的BJ-5183感受态细胞进行同源重组。同源重组后挑选出的阳性克隆质粒转化DH5α感受态细胞,扩增后抽提质粒经PacⅠ酶切鉴定,可得一条约30 Kb大小的片段和3 Kb或者4.5 Kb大小的片段。由此可知重组pAdeasy-Shuttle-Gαq质粒构建成功。（4）经PacⅠ线性化的pAdeasy-Shuttle-Gαq质粒转染HEK293A细胞,可观察到细胞病理变化（cytopathic effect,CPE）,即展开的细胞经病毒颗粒感染后出现细胞慢慢变圆、飘起的现象。CPE现象可以说明已包装出病毒颗粒。（5）经Western-blot检测感染腺病毒pAd-Gαq-GFP的HEK293A细胞中Gαq蛋白的表达量明显增加,表明该病毒可成功实现在体外培养的细胞中过表达Gαq蛋白的目的,能满足下一步的实验研究。结论:利用Adeasy腺病毒载体成功构建了含有小鼠Gαq基因的腺病毒颗粒,为下一步的实验研究奠定了基础。第二部分腺病毒pAd-Gαq-GFP转染乳鼠心室肌细胞及对细胞内钙信号的影响目的:通过腺病毒pAd-Gαq-GFP转染在离体培养的乳鼠左心室肌细胞（NRVMs）中过表达Gαq,通过激光共聚焦显微镜观察给予心肌肥厚激动剂AngⅡ和NE后心肌细胞内钙信号的变化,从而探讨Gq通路激活引起心肌肥厚与细胞内钙信号的关系。方法:（1）NRVMs的分离及培养:在无菌条件下,应用终浓度为0.04%胰酶、0.06%胶原酶Ⅱ的混合液反复消化出生2-3天的乳鼠心肌组织6-7次,用含10%FBS的DMEM培养基中和收集到的细胞悬液,用差速贴壁法和溴脱氧尿嘧啶（Brdu）相结合的方法纯化细胞,置CO2培养箱孵育。（2）腺病毒pAd-Gαq-GFP转染NRVMs:用稀释好的病毒液替换NRVMs的培养液,CO2培养箱孵育48 h,观察转染效率并经Westen-blot检测目的蛋白表达情况。（3）激光共聚焦显微镜下观察NRVMs内钙的变化:Rhod2-AM负载心肌细胞15 min后,灌流给予5μM AngⅡ和NE,观察心肌细胞内钙的变化。结果:（1）分离的NRVMs培养48h后心肌细胞展开并伸出的伪足,相互交织在一起形成多个细胞簇,每个细胞簇中的细胞呈放射状排列,并可同步化搏动,说明细胞状态良好。（2）将第一部分构建的重组腺病毒pAd-Gαq-GFP感染NRVMs细胞48h后,在激光共聚焦显微镜下观察可见大多数细胞具有绿色荧光的表达,说明腺病毒的转染效率较高,Westen-blot结果显示感染腺病毒pAd-Gαq-GFP的NRVMs细胞中Gαq蛋白的表达为对照组细胞的3.5倍,提示腺病毒pAd-Gαq-GFP感染成功在NRVMs细胞内过表达Gαq蛋白。（3）腺病毒转染48h后在激光共聚焦显微镜下观察给予5μM的AngⅡ或NE前后过表达Gαq蛋白的NRVMs细胞内钙的变化,结果显示与对照组相比5μM Ang II和NE可明显增加过表达Gαq的NRVMs细胞钙振荡的频率,而且过表达Gαq的NRVMs在Ang II作用下基础的钙升高幅度也明显增加。结论:Gαq蛋白在心肌细胞中过表达可显著影响心肌肥厚刺激因子引起的钙信号,进一步提示钙信号增强可能是Gq通路激活引起心肌肥厚的关键因素。