聚-β-羟基丁酸酯高产菌株的选育及发酵条件优化的初步研究

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由于石油资源的日益枯竭及其塑料制品对环境造成了日益严重的“白色污染”,因此,加快研究和开发可降解的环境友好型塑料,实现工艺上的突破,实现可降解塑料的产业化和实用化,对于防治环境污染和实现可持续发展具有重要的现实意义。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种微生物在碳氮失衡的情况下产生的一种塑料,是三大生物降解塑料(淀粉基塑料、聚乳酸、PHA)之一,聚-p-羟基丁酸酯(PHB)作为PHA家族的一份子,一直是研究的重点和热点。本实验从南宁等地区采集的样品中筛选PHB高产菌株,通过尼罗蓝染色法筛选出菌株CK-5, PHB产量为3.4g/L。用紫外诱变法、氯化锂诱变法、紫外氯化锂复合诱变法诱变菌株CK-5,得到菌株CK-U76,菌株CK-U76的PHB产量为4.6g/L,比菌株CK-5的PHB产量提高了35.3%。通过形态学观察和分子生物学鉴定,CK-U76被鉴定为芽孢杆菌属。通过Box-Behnken Design设计和响应面分析优化,对菌株CK-U76的发酵条件进行初步研究,得到菌株CK-U76最佳的发酵条件:以甘油为碳源,碳源浓度10.98g/L,酵母膏和蛋白胨作为联合氮源,氮源浓度25.25g/LpH为8.05,发酵温度为20℃,发酵时间为72h,转速为180r/min,装液量为150mL,接种量为10%。在此条件下菌株CK-U76的PHB产量达到15.9g/L,比未优化之前的4.6g/L提高了246%。本实验也对菌株CK-U76的提取方法进行了初步研究,从经济安全的角度来说,冻融法比较合适,综合PHB,提取率、PHB纯度、PHB分子量来说,SDS法最合适的提取方法,因此选择此方法作为PHB的提取方法。本实验采用紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法对菌株CK-U76的所产PHB进行定性定量分析,紫外分光光度法是比较灵敏的一种方法,在波长为235nm处对PHB进行定性定量分析,但是样品处理过程复杂,分析结果易受有机杂质干扰,影响其准确性;用高效液相色谱法来对PHB进行分析,操作方便,准确性较高,适合对PHB进行定向定量分析;气相色谱法的优点在于不需要对细胞进行处理,峰图较好,不过反应时间比较长,中间过程难以控制。本实验选育出一株PHB的菌株CK-U76,通过形态学观察和分子生物学鉴定,CK-U76被鉴定为芽孢杆菌属。运用响应面法优化菌株CK-U76的发酵条件,PHB产量从4.6g/L提高到15.9g/L。同时对其提取条件和分析方法进行了初步研究,对PHB的工业化生产可以提供一定的参考价值。
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