【摘 要】
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糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。目前临床上治疗糖尿病以注射外源胰岛素为主,但无法维持血糖长期稳定,并发症的风险依然存在。胰岛移植是解决这一难题的有效方法,但存在供体短缺、免疫排斥等问题。因此体外生成胰岛素分泌细胞（insulin producing cells,IPCs）代替胰岛移植成为研究热点。脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31872529）；
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糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。目前临床上治疗糖尿病以注射外源胰岛素为主,但无法维持血糖长期稳定,并发症的风险依然存在。胰岛移植是解决这一难题的有效方法,但存在供体短缺、免疫排斥等问题。因此体外生成胰岛素分泌细胞（insulin producing cells,IPCs）代替胰岛移植成为研究热点。脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）来源广泛,取材方便,免疫原性低,具有多向分化潜能,是新生IPCs比较理想的种子细胞。研究表明,ADSCs能够在体外诱导条件下分化为IPCs,但存在分化效率低,胰岛素分泌量少等缺点。在本实验室前期研究工作中,通过绝对定量转录组测序,筛选出体外诱导犬ADSCs向IPCs分化过程中新的差异表达基因FoxA1。为了验证FoxA1基因对体外犬ADSCs向IPCs分化的影响,本研究构建了FoxA1重组腺病毒表达载体,在293A细胞中包毒后,感染犬ADSCs,得到FoxA1基因过表达的ADSCs细胞株,结合体外诱导犬ADSCs向IPCs分化的程序,探究FoxA1基因过表达对体外犬ADSCs向IPCs分化的影响;通过构建FoxA1基因的siRNA载体,转染犬ADSCs,得到FoxA1基因干扰的ADSCs细胞株,结合体外诱导犬ADSCs向IPCs分化的程序,探究FoxA1基因干扰对体外犬ADSCs向IPCs分化的影响。胰腺发育级联调控关键基因（Pdx1、Ngn3、Pax4和Nkx2.2）单独或联合转入ADSCs,可诱导分化为IPCs,但往往分化效率不高,分化形成的IPCs不成熟。为进一步探究多基因联合转入犬ADSCs向IPCs分化的效率和分化形成的IPCs成熟度,本研究将FoxA1与Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx2.2基因构成不同的组合,分别为组合A:FoxA1+Pdx1+Ngn3、组合B:FoxA1+Pdx1+Ngn3+Pax4和组合C:FoxA1+Pdx1+Ngn3+Nkx2.2。在各基因序列后加入不同的2A肽序列,使用同源重组技术连接,构建多基因重组腺病毒载体,在293A细胞中包毒后,感染犬ADSCs,只经连续细胞培养,探究重编程犬ADSCs成为IPCs的最佳组合。主要结果如下:1、分别对FoxA1基因过表达和干扰的犬ADSCs诱导后细胞进行葡萄糖刺激分泌胰岛素试验和RT-qPCR检测胰岛β细胞相关基因的表达。发现与单纯诱导组细胞相比,FoxA1基因过表达组的细胞低糖刺激分泌胰岛素的量显著升高（p<0.05）,高糖和KCl刺激分泌胰岛素的量均极显著升高（p<0.01）,Pdx1、Mafa、Nkx6.1、Nkx2.2和Ins基因的表达极显著升高（p<0.01）;FoxA1基因干扰组高糖和KCl刺激分泌胰岛素的量均极显著降低（p<0.01）,Pdx1、Mafa、Nkx6.1、Pax4、Pcsk1、Pcsk2和Ins的表达极显著降低（p<0.01）。因此,FoxA1基因的表达促进体外犬ADSCs向IPCs的分化。2、分别对各组合联合转入犬ADSCs诱导向IPCs分化后的细胞进行成团数比较、双硫腙染色、葡萄糖刺激分泌胰岛素试验和RT-qPCR检测胰岛β细胞相关基因的表达。发现组合B和组合C的成团数显著高于组合A（p<0.05）;组合B的低糖、高糖和KCl刺激分泌胰岛素的量均极显著高于组合A和组合C（p<0.01）;组合B和组合C的Pdx1、Mafa、Nkx6.1、Pcsk2和Ins I基因的表达均极显著高于组合A（p<0.01）。因此,FoxA1、Pdx1、Pax4和Ngn3重编程犬ADSCs成为IPCs的效率最高,分化形成的IPCs最成熟。综上所述,FoxA1基因的表达促进体外犬ADSCs向IPCs的分化,FoxA1、Pdx1、Pax4和Ngn3可重编程犬ADSCs成为IPCs。
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