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假单胞菌能产生2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、氢氰酸(HCN)、藤黄绿菌素(Plt)、硝吡咯菌素(Prn)等多种抗生素和嗜铁素、蛋白酶等与拮抗相关的次级代谢产物,它们能抑制多种植物病原微生物,并且在植物根际中具有很强的定殖能力。因此,假单胞菌在植物病害的生物防治中有重大作用,开发假单胞菌资源及其应用在农业生产上具有十分重要的意义。从采自河南和江苏的健康番茄植株根际土样中分离出9株对青枯病病原菌Ralstonia solanacearum拮抗活性较高的菌株。通过形态学、生理生化特性和16SrRNA基因序列的分析,将其归类为4个属。从中选择拮抗活性较高的Pseudomonas brassicacearum J12和Pseudomonas fluorescens J2作为本论文的研究菌株。菌株J12能产生2,4-DAPG、HCN、噬铁素和蛋白酶,具有溶解磷能力和生物膜形成能力。在温度30℃、pH8.0,分别以葡萄糖和蛋白胨为碳氮源的条件下其生长量和拮抗活性达到最高。盆栽试验表明,J12对番茄青枯病的生防效率为45.5%. HPLC-ESI-MS分析结果表明J12的主要抗菌物质为2,4-DAPG。用PCR方法扩增菌株J12的2,4-DAPG的合成基因簇phlACBD (4.3kb),序列比对分析显示该基因簇与已报道的P. brassicacearum NFM421(CP002585)的phlACBD基因簇具有99%同源性。将菌株J12的phlACBD片段克隆到载体pMD19-T并导入到Escherichia coli DH5a中进行异源表达,结果表明E. coli DH5a重组菌株能够强烈抑制R. solanacearum生长,其表达产物经LC-MS分析确定为2,4-DAPG.利用Tn5转座突变成功将gfp基因随机插入到菌株J12的基因组中,在蓝色激发光下观察到菌体发出绿色荧光。标记菌株J12-gfp的拮抗活性、生长速度和生物膜形成能力都未受显著影响,J12-gfp的遗传稳定性为100%。利用GFP标记研究了菌株J12在番茄植株根际的定殖,结果表明菌株J12能在番茄植株根表和根际中定殖。菌株J2也能产生2,4-DAPG,其phlACBD基因簇序列也与已知序列具有高度相似性。其phlF基因位于phlACBD操纵子上游,负调控2,4-DAPG的合成。用PCR方法扩增到菌株J2中phlF基因(0.7kb),该基因序列与菌株P. fluorescens2P24的phlF具有99%的同源性。利用同源重组双交换技术,对菌株J2中的phlF基因进行敲除,成功构建了突变菌株J2-phlF。经测定,培养48h后突变菌株J2-phlF产生的2,4-DAPG水平比野生型提高了3倍。拮抗活性测定结果表明,突变菌株J2-phlF对R. solanacearum和Fusarium oxysporum的抑菌活性显著增强,盆栽试验表明,突变株J2-phlF的在番茄根际定殖能力有所增强,但和野生菌相比,突变菌株J2-phlF并没有对提高番茄青枯病的生防效率。phlE基因位于phlACBD操纵子下游,与2,4-DAPG的外运有关。PCR方法扩增得到菌株J2中的phlE基因(1.2kb),其氨基酸序列与菌株P. fluorescens2P24和F113的PhlE序列分别有99%和95%的同源性。菌株J2的PhlE没有信号肽,分子量为45.03kDa,其保守结构域属于major facilitator superfamily (MFS)家族,具有细胞跨膜蛋白特征。将phlE基因克隆到强表达载体pET28a(+),并导入到E. coli BL21(DE3)中进行表达,并把重组质粒p28-phlE导入到菌株J2中成功构建phlE强表达菌株J2-phlE.结果显示J2-phlE的胞外2,4-DAPG水平是野生菌株J2的4倍,显著提高了R. solanacearum的抑菌活性。