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前言肺癌是一种发病率和死亡率较高的恶性肿瘤,在我国近20年来城市恶性肿瘤死亡率中增长幅度最大,上升118.0%。目前以手术、放疗、化疗和生物免疫治疗为主的综合治疗总体疗效尚不理想。肺癌的侵袭和转移是临床治疗的主要障碍和造成肺癌患者死亡的主要原因之一,是个涉及多步骤的复杂过程,其中包括原发肿瘤浸润、基底膜降解、基质渗透以及肿瘤细胞进出血管和对靶组织的侵袭等环节。人们正从不同水平和不同途径对肿瘤转移发生的机制进行研究。在肿瘤侵袭、转移过程中,需要蛋白酶水解基底膜成分和细胞外基质大分子。在这些水解酶中,基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）因其作用底物广泛而最为重要,大多数恶性肿瘤中MMPs主要源自间质细胞,尤其是成纤维细胞。成纤维细胞平时分泌极少量的MMPs,但肿瘤细胞的存在可刺激其分泌大量的MMPs,降解细胞外基质成分,从而为肿瘤的侵袭、转移创造有利条件。CD147便是一种近年来发现的在肿瘤细胞中高表达的能刺激成纤维细胞大量分泌MMPs的刺激因子,成为目前研究的热点之一。CD147最初由Biswas等从肺癌细胞系LX.-中分离出来,是一类位于肿瘤细胞表面的属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,并命名为细胞外基质金属蛋白酶诱导物（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）。而后被不同实验室相继证实,并根据不同种属,将相继发现的CD147同源分子给予不同的命名:人体内称为EMMPRIN、基础免疫球蛋白（basic immunoglobulin,basigin）和M6;鸡体内称为HT7、neurothelin、5A11;大鼠体内称为OX-47、CE9;小鼠体内成为Basigin、gp42。CD147在体内分布很广泛,研究表明CD147在正常细胞中不表达或仅有少量表达,其中主要是角化细胞表达较低水平的CD147。在肿瘤组织中,尤其是恶性肿瘤组织中,CD147表达常较高,其在肿瘤的恶性转化、侵袭和转移及血管形成中发挥重要作用,目前己在肺癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、脑胶质瘤等细胞中克隆出CD147。CD147基因是一个具有多种功能的基因,不仅在多种恶性肿瘤中通过刺激肿瘤相关的间质成纤维细胞和内皮细胞产生MMPs,进而对肿瘤的侵袭和转移产生显著的作用。而且,周晟等研究还发现CD147在乳腺癌中的表达和肿瘤大小及分化程度有关,推测CD147可能在促进肿瘤细胞的增殖方面起一定的作用。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种双链RNA分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达使其沉默的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）。干扰性小RNA（small interferingRNA或shorting interfering RNA,siRNA）是RNA干扰作用得以发挥的重要中间效应分子,siRNA是一类长约21-25个核苷酸的特殊双连RNA（dsRNA）分子,它的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性。RNAi是一种生物进化过程中出现的高度保守现象,具有与基因敲除相媲美的功能,却比基因敲除技术操作快捷简单,并具有高效性、高稳定性,对细胞本身的调控系统没有影响的特点,而越来越受到人们的重视,成为近年来一种研究基因功能的新方法[25]。RNAi现象的发现也为肿瘤的基因治疗提供了一种新思路,通过RNAi技术抑制癌基因的表达,有可能成为肿瘤治疗的新策略。本文以人肺腺、鳞癌为研究对象,从蛋白和mRNA水平研究了CD147在肺腺、鳞癌中的表达及其临床意义;并进一步研究了CD147与基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达的相关性,探讨了CD147在肺腺、鳞癌侵袭、转移中的作用。本文还以人肺腺癌细胞株A2为研究对象,研究干扰CD147蛋白表达对肺癌细胞生物学行为的影响,进而探讨了CD147在肺癌细胞增殖中的作用。实验材料与方法一、实验材料1、选取中国医科大学附属第一医院胸外科2005年3月至12月55例肺癌手术患者,其中男34例,女21例,所有患者术前均未行放、化疗等辅助治疗,肿瘤均为单发。术后病理组织学分型依据世界卫生组织（WHO）1999年发布的非上皮性肿瘤分类标准:鳞癌31例,腺癌24例;术后病理分期根据1997年国际抗癌联盟TNM分期标准:Ⅰ期28例,Ⅱ期9例,Ⅲ期18例;淋巴结转移者27例,无淋巴结转移者28例。取部分肿瘤组织及邻近正常肺组织,立即放入液氮中,然后转入-70℃冰箱中保存。2、人肺腺癌细胞株A2,由中国医科大学肿瘤研究所第一研究室提供。二、实验方法1、免疫组化标本常规脱蜡至水,3%H2O2灭活内源性过氧化物10min。微波修复抗原,95-96℃min。正常山羊血清工作液封闭20min,倾去血清,加CD147一抗（1:50稀释）（购自北京中杉金桥生物技术公司）,4℃冰箱内过夜。加生物素化二抗工作液（购自北京中杉金桥生物技术公司）室温孵育20min。加辣根酶标记链霉卵白素工作液（购自北京中杉金桥生物技术公司）室温孵育20min,DAB显色,反应时间5min。苏木素复染,脱水透明封片。用PBS液代替一抗作为阴性对照。阳性结果判定标准:CD147染色阳性信号为棕色细颗粒状,定位于癌细胞膜及细胞浆中;MMP-2染色阳性信号为棕色颗粒,定位于癌细胞浆中。判定方法为在显微镜下观察,根据棕色反应的强度及面积判断结果。评分标准按Shimizu方法:对每张切片阳性细胞的阳性强度按淡黄色、棕黄色和褐色分别为1、2、3分;着色阳性面积按着色＜1/3、1/3-2/3、＞2/3分别为分1、2和3分。然后根据两项分数之和判定其结果,分数＞3分为阳性。2、RT-PCR切取少量癌组织及正常肺组织,RNAOUT试剂提取总RNA,行反转录及PCR扩增。RNA引物合成:Medline数据库中查找全基因序列,电脑软件primer5.0版自行设计引物,并由北京三博远志生物技术有限公司合成。CD147（229bp）:上游引物:5’-GATACTCCTCACCTGCTCCTTG-3’下游引物:5’-CGACTTCACAGCCTTCACTCT-3’β-actin（498bp）:上游引物:5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’下游引物:5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,自动成像系统照相,Band leader软件分析各条带mRNA含量与β-actin mRNA含量的比值,计算相对量。3、细胞培养用含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养基,37℃、5%CO2的培养箱中培养,细胞成单层贴壁生长,实验时取对数生长期的细胞。4、脂质体LipofectamineTM2000介导CD147siRNA转染人肺腺癌细胞A2人肺腺癌细胞株A2在RPIM1640完全培养液中常规培养,选择对数生长期细胞以1×105接种于12孔板,分四组进行实验,即A2组、A2-脂质体组、阴性对照组和A2-脂质体-CD147 siRNA组;每组设3复孔进行实验。荧光倒置显微镜下观察细胞生长情况。5、MTT法检测细胞增殖转染后24h到72h通过MTT法分别检测细胞增殖情况。取对数生长期A2细胞,以2×105/ml的密度接种于96孔板,在37℃5%CO2培养箱中培养24h,无血清饥饿细胞,细胞贴壁后进行转染。转染24h,48h,72h后,分别加入MTT（5mg/ml）,在酶标仪上测定波长490nm处的光密度值(A490),绘制生长曲线。实验结果一、肺腺、鳞癌组织中CD147的表达1、免疫组化本实验3例正常肺组织中均无CD147表达;而在所选择的55例肺癌组织中,有34例CD147阳性表达,CD147的阳性率为61.8%。其中肺腺、鳞癌的阳性表达率分别为66.7%（16/24）和58.1%（18/31）,二者差异无统计学意义（x2=0.424,P＞0.05）。有淋巴结转移患者的CD147阳性表达率为77.8%（21/27）,明显高于无淋巴结转移者46.4%（13/28）（x2=5.723,P＜0.05）。CD147的表达与肿瘤的TNM分期明显正相关,Ⅲ期肺癌患者的CD147阳性表达率为88.9%（16/18）明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者48.6%（18/37）,P＜0.05,（表1）。2、RT-PCRCD147在正常肺组织不表达,而在肺腺、鳞癌组织中表达明显增高,表达相对量为1.0907±0.2159。3、肺腺、鳞癌组织中CD147和MMP-2表达的相关性分析MMP-2在肺腺、鳞癌中的阳性表达率分别为75.0%（18/24）和54.8%（17/31）,二者差异无统计学意义（x2=2.07,P＞0.05）。有淋巴结转移患者的MMP-2阳性表达率为85.2%（23/27）明显高于无淋巴结转移者42.9%（12/28）（x2=10.64,P＜0.05）。MMP-2的表达与肿瘤的TNM分期正相关（x2=7.92,P＜0.05）,TNM分期越高,MMP-2的阳性表达率越高（表2）。对CD147和MMP-2在肺腺、鳞癌中的表达采用Spearman相关分析,相关系数rs=0.240,P=0.016,提示在肺腺、鳞癌中CD147和MMP-2的表达存在正相关性。二、CD147si RNA对人肺腺癌细胞株A2增殖及CD147表达的影响1、RT-PCR结果CD147mRNA在A2组、A2-脂质体组、阴性对照组中均较高表达,而在CD147siRNA转染组表达量明显减少。2、细胞增殖能力分析本研究采用MTT法比较了A2、A2-脂质体、阴性对照和A2-脂质体-CDl47siRNA各组细胞分别在转染24h、48h和72h的增殖情况。转染了CD147siRNA的细胞在24h、48h和72h的增殖能力较A2分别下降了48.3%（P＜0.05）,51.8%（P＜0.05）,53.2%（P＜0.05）。而A2-脂质体组细胞和阴性对照组细胞的增殖能力与A2相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1、CD147在正常肺组织中不表达,而肺腺、鳞癌中表达明显增高,且与肺腺癌、鳞癌组织学类型无关。2、CD147的表达与肺腺、鳞癌的淋巴结转移（N）及TNM分期正相关,推测CD147可能在肺腺、鳞癌的侵袭、转移中发挥一定作用。3、MMP-2在肺腺、鳞癌组织中高表达,且CD147与MMP—2的表达正相关。4、CD147siRNA能够有效地干扰人肺腺癌细胞株A2中CD147的表达。5、干扰肺腺癌细胞株A2中CD147的表达可一定程度上抑制细胞的增殖潜能。