第1章引言随着社会老龄化和生活方式西方化以及肥胖患病率增加,我国成人糖尿病患病率急剧上升,已成为危害国民生命健康的严重公共卫生问题。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）占糖尿病病例的90-95%,并与肥胖有关,而1型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus,T1DM）和其他类型糖尿病少见。糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）被认为是糖尿病主要的微血管并发症,大约40%的糖尿病患者可并发DN,进而增加慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）和终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）的发生风险。DN的发病机制目前被认为是多因素的,包括晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products,AGEs）、血流动力学改变、氧化应激、炎症、缺氧、自噬、细胞衰老和表观遗传学调控以及线粒体激效。瞬时受体电位通道（Transient receptor potential,TRP）是位于细胞膜上的一类非选择性阳离子通道分子家族,介导多种阳离子的跨膜运输。TRPM2、TRPM6和TRPM7是TRPM超分子家族的独特一类成员,它们结构上是由一个阳离子通道耦合一个羧基末端序列高度变化的功能酶结构域组成,也被称之为通道酶。TRPM2在中枢神经系统、心脏、骨髓、肾脏、肺、肝、胰腺、血管系统和造血细胞中广泛表达。通道和激酶的功能耦合与相互影响、广泛的体内表达谱和独特的生理特性使得TRPM2参与众多生理病理过程,如氧化应激、细胞凋亡与坏死、肺部或中枢神经系统疾病炎症反应、肾脏炎症和纤维化发生、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）、心脑肾缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）、心肌纤维化发生、糖尿病和肿瘤发生。TRPM2是细胞内氧化应激感受器,可被氧化应激相关疾病所激活,如阿尔茨海默病、缺血/再灌注损伤和糖尿病。当前,TRPM2在DN发生发展中是否扮演着重要作用尚不清楚。随着糖尿病流行和DN发病率的增加,考虑到TRPM2在心血管疾病和糖尿病中的重要作用,我们将探讨TRPM2蛋白是否在DN的分子致病机制扮演着重要的角色,是否可以作为DN干预治疗的潜在靶点,有助于制定改善DN的防治策略。第2章HFD/STZ诱导糖尿病肾病的炎症纤维化反应和TRPM2表达升高目的:在高脂饮食（High-fat diet,HFD）联合链脲霉素（Streptozotocin,STZ）诱导的2型糖尿病小鼠模型中,观察肾脏组织是否出现炎症反应和纤维化发生,TRPM2表达是否升高。方法:1)健康雄性7周龄小鼠（共18只）经适应性喂养1周后,随机分为三组:正常对照组（Control,6只）、高脂对照组（HFD-control,6只）、糖尿病组（Diabetes,6只）。2)生化指标检测:通过尾静脉采血测定小鼠空腹血糖。取材时通过心脏采血收集血清,测定小鼠血尿素氮和血肌酐水平。3)肾脏组织形态学观察:肾脏组织经4%中性多聚甲醛溶液固定2天后,制备石蜡切片,而后行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（Periodic Acid-Schiff,PAS）染色、天狼星红和Masson染色以及TRPM2/Antiaquaporin 1（APQ1,肾小管上皮细胞标志物）免疫荧光双重染色等检查。4)反转录酶-聚合酶链锁反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测TRPM2和相关炎症因子的m RNA表达。5)蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测TRPM2和纤维化因子的蛋白表达。6)酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA）检测肾脏匀浆组织相关炎症因子的表达。结果:1)与对照组和高脂饮食对照组相比,HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠高血糖峰值在30 mmol/L左右,伴有体重减轻,表明发生糖代谢紊乱,提示T2DM小鼠模型构建成功。2)与对照组和高脂饮食对照组相比,HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠血清肌酐和尿素氮水平明显升高,HE和PAS染色显示肾小球硬化,肾小球结构紊乱和近端小管损伤。Masson和天狼星红染色显示肾小球硬化,肾小管损伤,胶原纤维沉积在几根大血管附近。3)与对照组和高脂饮食对照组相比,HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏组织中,TRPM2 m RNA的表达水平明显升高,炎症因子IL-1β、IL-6、IFN-α、TNF-α、MCP-1的m RNA表达水平和组织匀浆浓度均明显高于其他两组小鼠。4)与对照组和高脂饮食对照组相比,HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏组织中,TRPM2蛋白、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）、I型胶原蛋白（Collagen I）和III型胶原蛋白（Collagen III）的蛋白表达水平升高。5)利用AQP1抗体特异性标记定位肾小管上皮细胞,进而评估TRPM2蛋白在肾小管上皮细胞中的表达变化。与对照组和高脂饮食对照组相比,HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏组织中,肾小管上皮细胞中TRPM2的荧光表达丰度增强。结论:1)在HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型中,肾脏组织出现炎症反应和纤维化发生。2)在HFD/STZ诱导的2型糖尿病肾脏病变中,TRPM2 m RNA和蛋白表达水平升高,且定位于肾小管上皮细胞中的TRPM2荧光表达丰度增强。第3章敲低TRPM2缓解HFD/STZ诱导所致糖尿病小鼠的肾脏炎症反应和纤维化发生目的:在HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型中,利用AAV-2重组载体系统经尾静脉注射定向感染肾脏组织,敲低TRPM2蛋白表达,观察是否改善糖尿病小鼠的肾脏炎症反应和纤维化发生。方法:1)24只6周龄雄性C57BL/6N品系小鼠经尾静脉注射AAV2/2-U6-sh TRPM2重组载体或空载体（~3×1011基因拷贝量）,靶向敲低肾脏TRPM2基因后（AAV2/2-N.C.空载体病毒不敲低TRPM2基因）,随机分为四组（每组6只小鼠）:1)AAV2/2-N.C.;Control组,2)AAV2/2-sh TRPM2;Control组,3)AAV2/2-N.C.;Diabetes组,4)AAV2/2-sh TRPM2;Diabetes组。经过2周感染后,AAV2/2-U6-sh TRPM2病毒载体可有效敲除TRPM2。2)构建2型糖尿病小鼠模型:8周龄糖尿病组小鼠经高脂饲料喂养4周后,在第5周一次性腹腔注射STZ（对照组小鼠注射等体积的枸橼酸钠缓冲液）,在注射3天后通过尾静脉采血测量空腹血糖,小鼠空腹血糖水平＞11.1 mmol/L,视为T2DM小鼠模型构建成功。3)生化指标检测:通过尾静脉采血测定小鼠空腹血糖。取材时通过心脏采血收集血清,测定小鼠血尿素氮和血肌酐水平。4)肾脏组织形态学观察:肾脏组织经4%中性多聚甲醛溶液固定2天后,制备石蜡切片,而后行HE染色、PAS染色、天狼星红和Masson染色以及TRPM2/APQ1免疫荧光双重染色等检查。5)RT-PCR法检测TRPM2和相关炎症因子的mRNA表达。6)Western blot检测TRPM2和纤维化因子以及信号通路分子的蛋白表达。7)ELISA法检测肾脏匀浆组织相关炎症因子的表达。结果:1)与Control组相比,HFD/STZ诱导的糖尿病小鼠高血糖峰值在20 mmol/L左右,体重下降,表明发生糖代谢紊乱,提示T2DM小鼠模型构建成功。然而,敲低TRPM2基因并未改变小鼠的血糖水平和体重变化,说明TRPM2并非通过改变血糖水平和体重影响糖尿病肾脏病变。2)与AAV2/2-N.C.;Control组相比,AAV2/2-N.C.;Diabetes组糖尿病小鼠的血清尿素氮和肌酐水平明显升高。与AAV2/2-N.C.;Diabetes组相比,AAV2/2-sh TRPM2;Diabetes组小鼠的血清尿素氮和肌酐水平下降。这些提示HFD/STZ诱导的T2DM小鼠出现肾脏功能障碍,而特异性敲低肾脏TRPM2基因后可部分改善其肾脏功能障碍。3)与AAV2/2-N.C.;Control组相比,AAV2/2-N.C.;Diabetes组糖尿病小鼠肾脏组织的TRPM2蛋白表达水平升高,且肾小管上皮细胞中TRPM2的荧光表达丰度增强,而通过尾静脉注射重组AAV2/2-sh TRPM2载体后,可有效敲低TRPM2的蛋白表达。4)与AAV2/2-N.C.;Control组相比,HE和PAS染色显示AAV2/2-N.C.;Diabetes组小鼠出现肾小球结构紊乱和近端小管损伤,Masson和天狼星红染色显示糖尿病小鼠出现肾小球硬化,肾小管损伤和间质纤维化。而敲低TRPM2后可改善糖尿病小鼠肾脏组织上述病理损伤。5)与AAV2/2-N.C.;Control组相比,AAV2/2-N.C.;Diabetes组糖尿病小鼠肾脏组织中,炎症因子IL-1β、IL-6、IFN-α、TNF-α、MCP-1的m RNA表达水平和组织匀浆浓度明显升高,而敲低TRPM2后可改善糖尿病小鼠的炎症因子表达水平。6)与AAV2/2-N.C.;Control组相比,AAV2/2-N.C.;Diabetes组糖尿病小鼠的肾脏纤维化标志物（TGF-β1、CTGF、α-SMA、FN、Collagen I和Collagen III）蛋白表达水平升高,敲低TRPM2后可改善糖尿病小鼠的纤维化因子蛋白表达。7)与AAV2/2-N.C.;Control组相比,AAV2/2-N.C.;Diabetes组糖尿病小鼠肾脏组织中JNK1、IKKα和NF-κB蛋白的磷酸化水平升高,而敲低TRPM2后可下调糖尿病小鼠肾脏组织JNK1、IKKα和NF-κB蛋白的磷酸化水平。结论:在HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型中,敲低TRPM2蛋白可改善糖尿病小鼠的肾脏炎症反应和纤维化发生,且此缓解作用与抑制TGF-β1/JNK1/NF-κB信号通路激活有关。第4章敲低TRPM2通过阻断TGF-β1/JNK1通路的激活改善高糖刺激HK-2细胞后的炎症纤维化反应目的:在体外细胞实验中,利用高糖刺激人肾脏近端小管上皮细胞株HK-2,模拟糖尿病肾脏损伤,使用小干扰RNA（Small interfering RNA,Si RNA）抑制TRPM2表达,观察其是否改善高糖诱导的炎症纤维化反应。方法:1)HK-2培养于D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的DMEM培养基中。在高糖（High-glucose,HG）处理时,使用33 m M D-葡萄糖刺激HK-2细胞24小时。2)Si RNA转染和细胞分组:Si-TRPM2或Si-NC转染HK-2细胞48小时后,再给予普通糖浓度或者高糖刺激HK-2细胞24小时。在另一组平行实验中,使用10μM JNK抑制剂SP600125孵育HK-2细胞1小时后,再继续给予普通糖浓度或者高糖刺激HK-2细胞24小时。3)Western blot检测HK-2细胞中TRPM2及相关蛋白的表达水平。4)RT-PCR检测HK-2细胞中TRPM2及相关基因的m RNA表达水平。结果:1)高糖处理显著提高TRPM2蛋白表达水平,使用si-TRPM2可有效下调HK-2细胞中TRPM2的蛋白表达水平。与对照组（NG+si-NC处理）相比,高糖处理显著增加了TGF-β1蛋白和磷酸化JNK1蛋白的表达水平,而使用si-TRPM2敲低TRPM2后可下调HK-2细胞中TGF-β1蛋白和磷酸化JNK1蛋白的表达水平。2)高糖处理显著增加HK-2细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、IFN-α、TNF-α、MCP-1的m RNA表达水平,而使用si-TRPM2敲低TRPM2后可下调高糖刺激HK-2细胞后炎症因子IL-1β、IL-6、IFN-α、TNF-α、MCP-1的m RNA表达水平。此外,10μM JNK抑制剂SP600125预孵育HK-2细胞后,可下调高糖刺激HK-2细胞后症因子IL-1β、IL-6、IFN-α、TNF-α、MCP-1的m RNA表达水平。3)高糖处理显著增加HK-2细胞中TGF-β1、CTGF、α-SMA、FN、Collagen I和Collagen III蛋白的表达水平,而使用si-TRPM2敲低TRPM2后可下调高糖刺激HK-2细胞后TGF-β1、CTGF、α-SMA、FN、Collagen I和Collagen III蛋白的表达水平。此外,10μM JNK抑制剂SP600125预孵育HK-2细胞后,可下调高糖刺激HK-2细胞后TGF-β1、CTGF、α-SMA、FN、Collagen I和Collagen III蛋白的表达水平4)高糖处理显著增加了HK-2细胞中TGF-β1蛋白、磷酸化IKKα和NF-κB蛋白的表达水平,而使用si-TRPM2敲低TRPM2后可下调高糖刺激HK-2细胞后TGF-β1蛋白、磷酸化IKKα和NF-κB蛋白的表达水平。此外,10μM JNK抑制剂SP600125预孵育HK-2细胞后,可下调高糖刺激HK-2细胞后磷酸化IKKα和NF-κB蛋白的表达水平。5)高糖处理显著增加了HK-2细胞中核蛋白NF-κB的表达水平,而使用si-TRPM2敲低TRPM2后可下调高糖刺激HK-2细胞后核蛋白NF-κB的表达水平。此外,10μM JNK抑制剂SP600125预孵育HK-2细胞后,可下调高糖刺激HK-2细胞后核蛋白NF-κB的表达水平。结论:1)在体外细胞实验中,高糖刺激显著增加HK-2细胞的炎症纤维化反应,且激活了TGF-β1/JNK1/NF-κB信号通路。2)使用si-TRPM2敲低TRPM2后可下调高糖刺激HK-2细胞后的炎症纤维化反应,抑制TGF-β1/JNK1/NF-κB信号通路的激活。3)JNK抑制剂SP600125预孵育HK-2细胞后,下调高糖刺激HK-2细胞后的炎症纤维化反应,抑制NF-κB炎症信号通路的激活。第5章总结当前,TRPM2在DN发生发展中是否扮演着重要作用尚不清楚。本研究发现,在HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型中,肾脏组织出现炎症反应和纤维化发生,TRPM2 m RNA和蛋白表达水平升高,且定位于肾小管上皮细胞中的TRPM2荧光表达丰度增强。这些研究结果提示TRPM2在DN发生发展中可能扮演着重要作用。接下来,为探索敲低TRPM2是否能缓解HFD/STZ诱导所致糖尿病小鼠的肾脏损害,我们在相应小鼠8周龄时,通过单次尾静脉注射~3×1011基因拷贝量的重组AAV2/2-sh TRPM2载体来敲低TRPM2的表达。研究发现,敲低TRPM2蛋白可改善糖尿病小鼠的肾脏炎症反应和纤维化发生,且此缓解作用与抑制TGF-β1/JNK1/NF-κB信号通路激活有关。糖尿病组糖尿病小鼠肾脏组织中JNK1、IKKα和NF-κB蛋白的磷酸化水平升高,而敲低TRPM2后可下调糖尿病小鼠肾脏组织JNK1、IKKα和NF-κB蛋白的磷酸化水平。体外细胞实验研究表明,利用高糖刺激人肾脏近端小管上皮细胞株（HK-2）,模拟糖尿病肾脏损伤,发现高糖刺激显著增加HK-2细胞的炎症纤维化反应,且激活了TGF-β1/JNK1/NF-κB信号通路,而使用Si-TRPM2敲低TRPM2后可下调高糖刺激HK-2细胞后的炎症纤维化反应,抑制TGF-β1/JNK1/NF-κB信号通路的激活。JNK抑制剂SP600125预孵育HK-2细胞后,下调高糖刺激HK-2细胞后的炎症纤维化反应,抑制NF-κB炎症信号通路的激活。这些研究结果首次证实在HFD/STZ诱导的小鼠2型糖尿病肾脏病变中,敲低TRPM2表达可通过抑制TGF-β1/JNK1通路激活改善糖尿病肾病的炎症纤维化反应。本研究可能为DN的诊疗提供一个新的治疗靶点,有助于制定改善DN的防治策略。