蛋白的重组表达被广泛应用于生命科学、生物技术、医学和材料科学等领域,有着巨大的社会效益与经济价值。在重组蛋白的表达过程中可根据自身性质选择合适的表达系统,来提高蛋白的表达效率。目前有多种蛋白表达系统,其中丝状真菌表达系统因其具有原料要求低、良好的转录后修饰和高分泌能力等一系列优点受到广泛的关注,许多不同种属的丝状真菌被开发成为蛋白表达宿主菌。草酸青霉（Penicillium oxalicum）是我国具有自主知识产权的木质纤维素降解酶产生菌,具有卓越的蛋白分泌能力以及非诱导条件下天然的低蛋白分泌背景等特点。本研究依托于草酸青霉良好的基因组学和蛋白质组学研究基础,从构建青霉低背景表达底盘、筛选高效表达元件、实现重组蛋白高纯度表达及优化等方面开展研究,以期构建一个适用于丝状真菌蛋白表达的成熟而通用的蛋白表达平台。本文主要的研究内容和研究结果如下:一.利用草酸青霉构建低分泌底盘细胞利用pyr G基因作为筛选标记,从本课题组构建的较低背景工程菌Δ13A-Oamy R菌株出发,以原生质体转化的方式导入淀粉酶基因amy15A的敲除盒,获得转化子Δ13A15A-Oamy R,菌株Δ13A15A-Oamy R中淀粉酶Amy15A的敲除使得胞外蛋白浓度进一步降低,从而获得更低分泌背景的宿主菌株。二.筛选强启动子来提高重组蛋白的表达在本研究中选用了两种强启动子。一个是在菌株Δ13A-Oamy R中受Amy R过表达而进一步高效表达的淀粉酶Amy15A的启动子Pamy15A（诱导型）,另一个是目前报道的草酸青霉中最强的组成型启动子Pubi D。在Δ13A15A-Oamy R菌株中利用这两个启动子,通过表达相同蛋白来比较得出两种启动子的启动效率。三.强启动子Pamy15A核心启动元件的鉴定Pamy15A是目前草酸青霉中在以淀粉为唯一碳源培养时发现的启动效率很高且可调的诱导型启动子。我们利用启动子梯度敲除的方式,获得Pamy15A启动区域长度分别为300-1400 bp（间隔约100 bp）的转化子,通过转化子中淀粉酶Amy15A的活性大小来比较其启动效率,鉴定分析了Pamy15A核心启动元件。四.通过RNA-Seq技术选择更强启动子和持续性激活G蛋白-c AMP进一步提高重组蛋白表达通过RNA-Seq技术分析了Δ13A-Oamy R菌株中的表达丰度,发现PDE＿07911（Extracellular membrane protein,Emp A）基因的表达量最大。因此利用它的启动子（简称Pemp A）在Δ13A15A-Oamy R菌株中表达重组蛋白,通过与启动子Pamy15A控制下的蛋白表达效率进行比较,得出在Δ13A15A-Oamy R菌株中启动子Pemp A更能提高重组蛋白的表达量。以原生质体转化的方式持续激活重组蛋白表达工程菌中的G蛋白-c AMP途径,也能够进一步特异性提高重组蛋白表达。五.多肽在Δ13A15A-Oamy R菌株中的异源表达探索研究利用一步克隆的方式将优化后的目标基因导入之前研究中构建的启动子Pemp A控制下的通用蛋白表达质粒h-Pemp A-T15A。再利用已构建的淀粉酶Amy15A和Amy13A的双缺失菌株Δ13A15A-Oamy R进行目标多肽的异源表达。