前言　　研究表明，活化T细胞核因子(thenuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)家族成员在许多人类恶性病变中具有肿瘤转型功能。NFAT1是该家族的一个重要成员，其活化既能够诱导T细胞的活化和增殖，又能够通过上调FasL表达，在成熟T细胞中引起“活化诱导的细胞死亡”(activation-inducedcelldeath，AICD)。据报道，NFAT1和众多肿瘤细胞的存活、凋亡、迁移及侵袭相关，而NFAT1在胶质瘤中的研究尚属空白。我们以往实验显示，在多形性胶质母细胞瘤(GBM)中，白介素-13受体α2亚单位的表达增高受NFAT1调控，因此我们推测，NFAT1可能在GBM中表达上调并且活化。如同在T细胞和其他肿瘤中，在胶质瘤细胞中，NFAT1也可能调节增殖及侵袭。而影响NFAT1活性的药物可能对胶质瘤产生影响。此外，由于NFAT1与免疫系统联系紧密，对NFAT1的研究可能成为连接胶质瘤化疗和免疫治疗的纽带。本研究旨在探讨NFAT1在不同级别胶质瘤中的表达情况和作用，以及相关的分子机制。　　材料和方法　　1、mRNA芯片分析　　利用中国脑胶质瘤基因组图谱计划111例临床胶质瘤标本mRNA表达Microarray数据库，运用聚类分析法，考察NFAT1在胶质瘤中的表达情况。运用聚类分析和Pearson相关分析，考察NFAT1mRNA表达与侵袭相关基因表达、Fas表达的关系。　　2、RT-PCR　　通过RT-PCR进一步验证NFAT1在24例GBM及GBMU87、U251细胞系中的表达。通过RT-PCR考察NFAT1基因敲除对侵袭相关基因表达的影响。　　3、免疫组织化学染色及免疫荧光染色　　通过免疫组织化学染色法，在50例胶质瘤（25例GBM和25例星形细胞瘤）中考察NFAT1的表达和细胞内定位情况。通过免疫荧光染色，在U87细胞中，考察NFAT1的表达和活性，以及环孢素(CsA)、FK506、PMA和离子霉素对NFAT1活性的影响。　　4、NFAT1基因沉默　　运用shRNA转染技术，在U87、U251细胞中稳定敲除NFAT1表达。通过RT-PCR及westernblot检测基因沉默效果。　　5、细胞增殖实验　　通过MTT实验及细胞计数检测细胞增殖情况，明确NFAT1基因沉默对细胞增殖的影响，以及CsA、FK506、PMA和离子霉素对GBM细胞增殖的影响。　　6、体外侵袭实验　　通过TranswellMatrigel实验检测细胞侵袭力。明确NFAT1基因沉默对细胞侵袭力的影响，以及CsA和FK506对GBM细胞侵袭力的影响。　　7、碘化丙啶染色流式细胞仪　　通过碘化丙啶(PI)染色流式细胞仪检测细胞周期、细胞死亡情况。明确NFAT1基因沉默以及PMA和离子霉素对GBM细胞周期、细胞死亡的影响。　　8、透射电镜　　通过透射电镜形态学观察，检测PMA和离子霉素对GBM细胞、染色质、细胞核形态的影响。定性分析PMA和离子霉素对GBM细胞凋亡的影响。　　9、TUNEL实验　　运用TUNEL实验定量分析NFAT1基因沉默以及PMA和离子霉素对GBM细胞凋亡的影响。　　10、Real-timePCR和Westernblot　　运用real-timePCR和westernblot检测NFAT1基因沉默以及PMA和离子霉素对GBM细胞Fas/FasL表达的影响。　　11、统计学分析　　芯片分析获得的mRNA表达数据用于聚类分析和Pearson相关分析。聚类分析采用averagelinkage层次聚类法，聚类分析结果用TreeView软件显示。卡方检验及t检验用于检测差异显著性。所有数据由至少三次实验得到的均数±标准差表示。双尾P＜0.05认为有统计学意义。　　结果　　1、NFAT1在GBM临床标本和细胞系中高表达　　mRNA芯片分析显示，和低级别胶质瘤相比，NFAT1在GBM中高表达。RT-PCR进一步证实NFAT1在GBM临床标本及U87、U251细胞中高表达。免疫组织化学染色显示，在星形细胞瘤中，NFAT1表达水平较低;在GBM中，NFAT1高表达，并且位于细胞核内。　　2、NFAT1在GBM细胞中活化且有不同的活化程度　　免疫荧光染色显示，NFAT1在U87、U251细胞中高表达，并且主要位于细胞核内，处于活化状态，而CsA和FK506能够抑制NFAT1活性;PMA和离子霉素则能够进一步激活NFAT1，使其处于过度激活状态。　　3、NFAT1活性抑制或表达下调能够降低GBM细胞侵袭力　　TranswellMatrigel实验显示，药物抑制NFAT1活性，或者特异性敲除NFAT1表达，能够明显降低U87细胞的侵袭力。　　4、NFAT1活性抑制或表达下调对GBM细胞增殖无明显影响　　MTT实验证实，药物抑制NFAT1活性，或者特异性敲除NFAT1表达对U87细胞增殖无明显影响。PI染色流式细胞显示NFAT1基因沉默对U87细胞周期无明显影响。　　5、在GBM中NFAT1表达和Cox-2，MMP-7，MMP-9表达相关　　利用111例胶质瘤mRNAmicroarray数据，采用聚类分析及Pearson相关分析，我们发现，在胶质瘤中NFAT1表达与侵袭相关基因Cox-2、MMP-7、MMP-9表达明显相关。RT-PCR证实，NFAT1基因敲除明显抑制Cox-2、MMP-7、MMP-9表达。　　6、PMA和离子霉素抑制GBM细胞增殖　　MTT实验及细胞计数显示，加入PMA和/或离子霉素后，U87及U251细胞增殖显著降低（P＜0.05）。　　7、PMA和离子霉素诱导GBM细胞凋亡　　透射电镜形态学观察显示，加入PMA和离子霉素后，GBM细胞出现明显的凋亡形态学特征;TUNEL实验证实，加入PMA和/或离子霉素后，GBM细胞凋亡明显增多。　　8、PMA和离子霉素诱导GBM细胞周期阻滞和细胞死亡　　PI染色流式细胞仪检测发现，加入PMA和离子霉素后，GBM细胞出现明显的G0/G1期细胞周期阻滞，sub-G0期成分增多。　　9、在胶质瘤中NFAT1表达和Fas表达相关　　利用111例胶质瘤mRNAmicroarray数据，采用聚类分析及Pearson相关分析，我们发现，在胶质瘤中NFAT1表达与Fas表达明显相关。　　10、下调NFAT1表达阻碍PMA和离子霉素诱导GBM细胞死亡　　MTT实验和细胞计数显示，NFAT1基因沉默降低PMA和离子霉素对GBM细胞增殖的抑制作用;TUNEL实验证实，NFAT1基因沉默抑制PMA和离子霉素诱导的GBM细胞凋亡;PI染色流式细胞仪检测发现，NFAT1基因沉默抑制PMA和离子霉素诱导的GBM细胞周期阻滞及细胞死亡。　　11、PMA和离子霉素通过NFAT1上调FasL表达　　Real-timePCR和westernblot显示，在GBM细胞中，PMA和离子霉素明显上调Fas/FasL表达;而NFAT1基因沉默明显抑制PMA和离子霉素诱导的FasL表达。　　12、中和FasL抑制PMA和离子霉素诱导的GBM细胞凋亡　　TUNEL实验显示，使用特异性抗体中和FasL明显抑制PMA和离子霉素诱导的GBM细胞凋亡。　　结论　　1.NFAT1在GBM细胞中表达上调。　　2.在GBM细胞中，NFAT1具有不同的活化程度，普通活化和过度激活。　　3.普通活化时，NFAT1能够调节GBM细胞的侵袭性。　　4.当NFAT1被PMA和/或离子霉素过度激活时，则能够诱导AICD样现象，引起GBM细胞死亡。　　5.调控NFAT1的表达及活性，可能为GBM治疗提供新的方法和思路。