第一部分血管活性肠肽对枯否细胞Toll样受体4表达的作用目的：研究血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide, VIP)对枯否细胞(Kupffer Cells, KCs)的活性及其表面Toll样受体(Toll like receptor, TLR) 4表达的影响并阐明机制。方法：采用胶原酶原位灌注法分离及提纯枯否细胞。将细胞分为3组：A组为对照组(Control group),培养正常大鼠KCs；B组为脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激组(LPS group),在开始培养KCs时,培养液中加入终浓度为10mg/1 LPS；C组为LPS+VIP组(VIPgroup),培养液中先加入1×10-8mol VIP培养24h,然后再加入10mg/lLPS。各组分别于培养6h后获取标本作相应指标检测,重复8次实验后取均值(n=8)。将各组细胞置于倒置显微镜下观察其形态变化,碳粒吞噬实验检测各组枯否细胞吞噬活性,抗单核巨噬细胞胞质抗原(ED-2)免疫组化染色检测纯度,反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测枯否细胞TLR4及核因子KB(Nuclear transcription factor kappa B, NF-κB) mRNA表达情况,蛋白质印迹分析(Western blot)检测TLR4及NF-κB蛋白水平,电泳迁移率分析(EMSA)检测NF-κB DNA结合活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞上清液中IL-1和TNF-α水平。结果：新分离的KCs在倒置显微镜下呈球形,悬浮于培养基中；约6h后,大部分细胞贴壁呈扁圆形,少数细胞伸出伪足；24h后大部分细胞伸出伪足,约48h后所有细胞已完全展开,呈典型星形和多角形,细胞体积明显变大；细胞爬片后苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色,KCs呈典型星状,胞核呈肾形；各组枯否细胞分离纯度约为90%,活性约为96%。吞噬能力检测与B组比较,C组细胞内的碳粒密度明显低于前者,细胞形态未发生明显改变；与A组比较,B组TLR4、NF-κB在mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),与B组比较,C组上述指标水平显著降低(P<0.05)；与A组比较,B组NF-κB DNA结合活性显著增高(P<0.05),与B组比较,C组NF-κB DNA结合活性显著降低(P<0.05)；与A组比较,B组IL-1和TNF-α水平明显增高(P<0.05),与B组比较,C组IL-1和TNF-α水平明显较低(P<0.05)。结论：(1)采用胶原酶原位灌注法分离及提纯的肝脏枯否细胞纯度可达90%,活性约为96%；(2)VIP能抑制枯否细胞吞噬活性,从而减少枯否细胞激活后释放TNF-α及IL-1；(3)VIP能抑制枯否细胞TLR4的表达及NF-κB的激活；第二部分大鼠原位肝移植模型的建立目的：建立稳定的大鼠原位肝移植模型。方法：采用改良Kamada’s“两袖套法”建立大鼠肝移植模型。模型的建立均采用封闭群雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,受体略大于供体。术后饲喂10%葡萄糖水,前3d肌注10万U青霉素,术后均不使用免疫抑制剂。结果：建模初期共完成30例,仅有2例完成了手术全过程,其余28例均在手术过程中死亡,死亡原因为大出血9例,麻醉意外8例,气胸5例,血管意外损伤4例,原因不明2例。成功2例分别于术后第0.5h,2h后死于肝上下腔静脉(Suprahepatic inferior vena cave,SIVC)吻合口出血；建模成熟稳定期共完成100例定型手术,供肝获取时间为45-60min,热缺血时间0-0.5min,供肝修整时间为12-15min,供体冷保存时间为2h,受体手术时间为85-100min,其中无肝期18-22min。24h存活率为92.0%(92／100),1w存活率为83.0(83／100)。手术失败或24h内死亡8例：麻醉意外3例,术中大失血4例,膈肌破裂导致气胸1例；1d-7d内死亡9例：感染4例,胆漏3例,原因不明2例。结论：(1)采用改良Kamada’s“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型稳定可靠,可为后继实验研究提供基础。(2)大鼠原位肝移植手术难度大,尽量缩短手术时间和无肝期以及精细的吻合技术是手术成功的关键。第三部分血管活性肠肽对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤的作用目的：研究血管活性肠肽在大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤中的作用及其可能机制。方法：供、受体均采用雄性SD,将实验动物随机分为3组,n=8：A组为假手术组,开腹后游离肝周韧带,解剖肝门后关腹；B组为VIP组,供体术前3d隔日经腹腔注射VIP 2nmol;C组为对照组,供体术前隔日经腹腔注射等量生理盐水。采用改良Kamada’s’‘两袖套法”建立大鼠肝移植模型,24h后处死大鼠检测血清谷丙转氨酶(Alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)水平,RT-PCR检测TLR4及NF-κB mRNA表达水平,Westernblot检测TLR4及NF-κB蛋白含量,EMSA法检测NF-κB DNA结合活性,ELISA法检测血清IL-1和TNF-α水平,dUTP原位缺口末端标记技术(Terminal deoxynecleotidy transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法检测肝组织凋亡情况,并计算凋亡指数,肝组织HE染色后置光镜下观察病理形态学变化,并根据Suzuki’s评分标准进行半定量评分。结果：B、C两组供体获取时间,热缺血时间,无肝期及受体手术时间比较无显著性差异(P>0.05)；与C组比较,B组血清ALT、AST水平明显降低(P<0.05)；与C组比较,B组TLR4及NF-κB在mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与C组比较,B组NF-κBDNA结合活性明显降低(P<0.05)；与C组比较,B组血清IL-1、TNF-α及AI明显降低(P<0.05)；与C组比较,B组淤血、空泡变性及坏死Suzuki’s评分均较低(P<0.05)。结论：(1)VIP能下调大鼠移植肝脏内枯否细胞TLR4的表达；(2)VIP能降低大鼠移植肝脏内NF-κB的活性；(3)VIP能减少细胞因子释放,对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用；(4)VIP对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用机制是通过抑制TLR4表达及NF-κB活化实现的。第四部分血管活性肠肽诱导大鼠肝脏免疫耐受的研究目的：探讨血管活性肠肽在诱导大鼠肝脏免疫耐受中的作用并阐明其相关机制。方法：实验动物为雄性SD大鼠及Wistar大鼠,清洁级。实验动物随机分为4组,n=16,其中8只用以取标本检测,其余8只观察生存期(死亡当天为生存期,超过5w则视为长期存活)：A组为同基因组,SD→SD,术前3d供体隔日经腹腔注射VIP 2nmol,术后受体隔日腹腔注射VIP 2nmol 3次(d1,d3,d5)；B组为排斥组,SD→Wistar,不做任何预处理；C组为VIP组,SD→Wistar,术前3d供体隔日经腹腔注射VIP 2nmol,术后受体隔日腹腔注射VIP 2nmol 3次(d1,d3,d5)；D组为对照组,SD→Wistar,术前3d供体隔日经腹腔注射等量生理盐水,术后受体隔日腹腔注射等量生理盐水3次(d1,d3,d5)。采用第二部分所述改良Kamada’s“两袖套法”建立肝移植模型。移植后7d将各组动物处死8只(其余继续喂养观察生存期),检测血清ALT、AST及总胆红素(Total bilirubin, TBIL), RT-PCR检测IL-2,IL-4,IL-10、干扰素(Interferon, IFN)-γ、TLR4 mRNA表达,Western blot检测各组TLR4蛋白表达水平,ELISA法检测各组血清IL-2,IL-4,IL-10及IFN-γ浓度,TUNEL法检测肝组织凋亡情况,并计算凋亡指数,各组肝组织HE染色后置光镜下观察病理形态学变化,并根据Banff’s系统分级评分方案对各组排斥反应程度进行半定量评估。结果：与D组比较,C组大鼠生存期较长(P<0.05)；与D组比较,C组大鼠血清ALT、AST及TBIL水平较低(P<0.05)；与A组比较,B、D两组大鼠TLR4 mRNA及其蛋白表达水平明显升高(P<0.05),C组表达水平与之无显著性差异(P>0.05)；IL-2及IFN-γmRNA在A组未检测到表达；与D组比较,C组IL-2及IFN-γmRNA表达明显减少(P<0.05)；与A组比较,B、D组大鼠IL-4及IL-10 mRNA表达水平较低(P<0.05),C组表达水平与之无显著性差异(P>0.05)；与D组比较,C组血清IL-2及IFN-γ浓度较低(P<0.05)；与A组比较,B、D组大鼠血清IL-4及IL-10浓度水平较低,C组与之无显博士学位论文中文摘要著性差异(P>0.05)；与D组比较,C组AI及RAI均较低(P<0.05)。结论：(1)VIP通过上调Th2型细胞因子水平诱导移植物的免疫耐受,对大鼠移植肝脏术后急性排斥反应产生保护作用；(2)VIP上调Th2细胞因子分泌的作用与其抑制TLR4表达有关；(3)TLR4对Th1／Th2细胞分化有调控作用。