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目的:肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因,全球每年新发病例150万,严重威胁人类健康。其中,非小细胞肺癌占肺癌的80%-85%。然而,多数患者确诊时已处于肺癌晚期,失去了手术治疗的机会。随着精准医疗的提出,肿瘤个体化治疗,即靶向用药在肿瘤治疗中起到相当重要的作用。为了给临床医生在肺癌靶向治疗过程中提供建议,本研究拟建立了基于Ion Torrent PGM平台肺癌用药基因检测的方法。方法:结合COSMIC、NCBI、Ensemble数据库、肿瘤个体化治疗检测技术指南、查阅相关文献,选取基因EGFR的18、19、20、21号外显子,BRAF基因的11、15号外显子,KRAS基因的2、3、4号外显子作为肺癌用药基因检测研究的目的区域。首先针对9条目的序列进行特异引物,即首尾扩增引物的设计,引物设计合成后进行验证。其次,根据Life的Fusion Method方法设计基于Ion Torrent PGM平台的融合引物,即PGM扩增子建库用引物,共设计5套融合引物,总计45对。引物设计合成后进行验证。同时,针对9条目的序列设计9对定量引物,用来检测多重PCR扩增的均一性。以A549细胞为实验材料,用天根公司的组织、细胞DNA提取试剂盒提取A549 DNA。接着对多重PCR反应条件和反应体系进行优化,即在QPCR的检测基础之上不断进行优化,确定最终9重PCR文库构建方法。构建包含9条序列的野生质粒和突变质粒,作为参考品。最后,用优化好的多重PCR反应体系和条件进行文库构建,上机测序,测序数据用Ion Torrent PGM自带的插件和第三方软件Nextgene来进行分析。结果:1针对选取的9条目的序列设计的特异引物,PCR扩增后用琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 DNA检测,结果显示引物设计成功。PCR产物大小分别为177bp、173bp、262bp、208bp、257bp、218bp、124bp、296bp、264bp。设计了5套基于PGM平台的融合引物,即扩增子建库用引物。PCR扩增后产物用琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 DNA进行检测,目的片段大小正确。大小分别为240bp、231bp、316bp、263bp、273bp、313bp、182bp、352bp、321bp。用一代测序进行序列验证,结果表明5套基于PGM平台的融合引物设计成功,可以用于PGM平台文库的构建。2构建的包含9条序列的野生质粒和突变质粒,经过一代测序验证,结果表明野生质粒和突变质粒构建成功。构建的突变质粒包含突变位点有:EGFR18（G719A）,EGFR19（E746A750del/D761Y）,EGFR20（T790M/D770N771ins CCA）,EGFR21（L858R）,BRAF11（G464E/G466A/G469A）,BRAF15（V600E）K2（G12D/G13D）,k3（Q61H）,k4（A146T）。同时,成功设计了9对用于检测多重PCR扩增均一性的定量引物。3多重PCR体系和反应条件经过不断摸索,最终PCR体系为:2xMultiplex PCR Master Mix 10μl,模板DNA 1μl,Primer Mix 7.7μl（0.6μl/0.5μl/1.3μl/0.55μl/1.3μl/0.9μl/0.65μl/1.1μl/0.8μl）,dd H20 1.3μl。多重PCR反应体系为20μl;9重PCR反应条件为:95℃预变性15min,95℃变性30s,55℃退火30S,72℃延伸45 s,总计26循环。72℃终延伸30min。用5套融合引物按照优化后的9重PCR条件进行扩增子文库构建,然后上机测序。测序数据用Ion Torrent PGM自带的插件和第三方软件Nextgene来进行分析。结果显示数据质量良好。结论:本研究初步建立了基于PGM平台的非小细胞肺癌用药基因检测的方法,可以为非小细胞肺癌病人的个体化治疗,即靶向用药提供建议。