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菰黑粉菌(Ustilago esculenta)属于担子菌门黑粉菌科,其侵染茭白植株(Zizania latifolia)后可抑制植株抽穗开花并诱导茎部膨大形成可食用的茭白。茭白是我国传统的水生蔬菜,广泛种植于江浙一带,有着丰富的营养价值和药用价值。研究发现,菰黑粉菌存在酵母型和菌丝型两种型态,是一种典型的二态性真菌。酵母型菰黑粉菌没有致病性,而菌丝型具有致病性,酵母型菌株以芽殖的方式增殖,当两个具有不同遗传交配基因的酵母型单倍体相互识别后形成接合管发生融合,从而形成具有侵染能力的双核菌丝,表现出致病性。真菌细胞壁是其生长发育和致病的关键结构,几丁质(chitin)作为细胞壁重要的组成成分,与葡聚糖、甘露聚糖等一起构成细胞壁坚硬的骨架,对于真菌细胞起着重要的保护作用。几丁质合成酶(chitin synthase,CS)负责几丁质合成的最后一步,将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)通过β-1,4糖苷键聚合形成几丁质。目前在真菌中共发现7类几丁质合成酶,参与真菌的生长发育、侵染寄主、孢子形成等多个过程。目前对于菰黑粉菌中几丁质合成酶的功能尚未明确,系统研究菰黑粉菌几丁质合成酶家族不同基因的功能可以为研究菰黑粉菌的致病机理提供基础。本研究在菰黑粉菌基因组中共鉴定得到9个几丁质合成酶,通过基因敲除的方法得到了几丁质合成酶基因缺失的突变菌株,分析比较了突变菌株与野生型菌株在芽殖生长、菌丝融合生长、致病力等方面的差异,并通过构建UeCS-eGFP表达菌株对几丁质合成酶的极性定位进行了研究,主要研究结果如下:本研究以菰黑粉菌为实验材料,通过分子生物学的方法在菰黑粉菌中共克隆得到9个几丁质合成酶基因,根据它们所编码的氨基酸序列,通过结构域分析和系统进化分析,将这9个基因归类于6类几丁质合成酶,并分别命名为:UeCS1.1(Ⅰ类)、UeCS1.2(Ⅰ类)、UeCS2.1(Ⅱ类)、UeCS3.1(Ⅲ类)、UeCS4.1(Ⅳ类)、UeCS4.2(Ⅳ类)、UeCS5.1(Ⅴ类)、UeCS5.2(Ⅴ类)和UeCS7.1(Ⅶ类)。为了进一步研究菰黑粉菌几丁质合成酶家族的生物学功能,本研究通过原生质体转化及同源重组技术,获得T型菰黑粉菌各UeCS基因缺失突变菌株。发现在T型菰黑粉菌芽殖过程中,ΔUeCS1.1、ΔUeCS1.2、ΔUeCS4.1、ΔUeCS4.2、ΔUeCS5.1和ΔUeCS5.2的生长速率都比野生型菌株减慢,并且ΔUeCS4.1、ΔUeCS4.2、ΔUeCS5.1和ΔUeCS5.2菌株的形态异常,ΔUeCS4.1菌株芽殖时有分叉,ΔUeCS4.2菌株更长并且不规则生长,形成像细胞链的结构,ΔUeCS5.1和ΔUeCS5.2菌株局部膨胀,芽殖时顶端出现了气球状结构。说明Ⅰ类、Ⅳ类和Ⅴ类几丁质合成酶参与调控T型菰黑粉菌的芽殖生长。体外融合实验中,与野生型相比,UeCS2.1、UeCS3.1、UeCS4.1、UeCS4.2和UeCS5.2缺失菌株更晚形成接合管或不能形成接合管,菌丝生长明显减弱,说明UeCS2.1、UeCS3.1、UeCS4.1、UeCS4.2和UeCS5.2参与调控T型菰黑粉菌的菌丝生长。接种实验发现在菰黑粉菌侵染过程中,与野生型相比,UeCS2.1、UeCS4.1和UeCS5.1缺失菌株致病力下降,由此得知,UeCS2.1和UeCS4.1和UeCS5.1参与调控T型菰黑粉菌的致病性。几丁质合成酶在真菌中的极性定位以及几丁质的极性累积对真菌的生长起着关键作用。通过将绿色荧光蛋白eGFP与几丁质合成酶UeCS融合表达,我们对UeCS在菰黑粉菌中的亚细胞定位进行观察,其中UeCS2.1、UeCS4.1、UeCS4.2和UeCS5.2定位在酵母型细胞的出芽位点顶端,UeCS4.2和UeCS5.1定位于子母细胞的隔膜处。进一步通过BDM、Colchicine、cAMP处理表达菌株发现菌株的极性定位发生了改变,说明菰黑粉菌几丁质合成酶的定位可能与F-actin、tubulin及PKA信号途径有关。上述研究结果表明,在T型菰黑粉菌整个生活史的不同阶段,不同的几丁质合成酶所发挥的作用及重要性有所不同,所有的几丁质合成酶协同作用,共同维持T型菰黑粉菌的芽殖、菌丝融合生长以及致病力,为研究菰黑粉菌的致病机理提供了基础材料。同时通过对几丁质合成酶的亚细胞定位的研究初步了解了几丁质的合成需要调控几丁质合成酶的定位,至于菰黑粉菌通过何种途径调节几丁质的合成还需进一步探究。