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已有研究表明,花生中具有抑制肿瘤增殖的蛋白,并初步揭示该过程与诱导细胞凋亡等有关。但对于花生的2s清蛋白抗肿瘤作用未有研究报道。本实验首次研究花生2s清蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用、诱导肿瘤细胞凋亡及其相关的分子生物学机制等方面进行比较深入的探索,为研究和开发花生抗肿瘤药物提供实验和理论依据。
采用四甲基偶氮唑盐法即MTT法,研究花生2s清蛋白粗品对人肺腺癌A549.细胞系细胞增殖的影响。发现花生2s清蛋白粗品能够明显抑制A549细胞的增殖,且呈现时间和剂量依赖性。将2s清蛋白粗品进行Native-PAGE,发现花生2s清蛋白粗品在天然状态下存在Ⅰ~Ⅸ共九个组分,然后从凝胶中直接回收每个组分蛋白,用MTT检测各个组分对A549细胞增殖的抑制作用。发现Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ显示对A549细胞的生长有明显的抑制作用。将蛋白粗品经Sepharose4B柱层析后获得较纯的2s清蛋白,Native-PAGE分析也显示四个组分,与2s蛋白粗品中Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ吻合,因此可以确定花生2s清蛋白粗品种起抑制肿瘤细胞增殖作用的为2s清蛋白。
以A549细胞为模板,研究花生2s清蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的作用,通过MTT法检测,2s清蛋白对A549细胞的增殖有抑制作用,呈时间和剂量依赖性。在100μg/mL2s清蛋白作用细胞24h后,A549细胞的生长抑制率达到50%以上。分别应用光学倒置显微镜、苏木素-伊红染色观察、荧光显微镜观察细胞形态变化,都检测到细胞凋亡时所具有的典型形态学变化。通过流式细胞仪检测发现,花生2s清蛋白能够将A549细胞阻滞在G1期,抑制细胞的增殖,从而诱导细胞凋亡;且不同浓度花生2s清蛋白作用A549细胞不同时间后,细胞早期凋亡率呈现先上升后下降的趋势,其中100μg/ml2s清蛋白作用细胞6 h后早期凋亡率最高,达30.5%。上述实验从不同角度证明花生2s清蛋白确实通过诱导A549细胞发生凋亡而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。
采用分光光度法法检测与细胞凋亡信号通路途径相关的一些蛋白活性变化表明,随着2s清蛋白的作用,Caspase-3、Caspase-9酶原被激活,而Caspase-8活性没有明显变化;进一步用Western blotting方法检测相关蛋白表达情况表明,经2s清蛋白处理的细胞,Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Caspase-12表达量明显上升,但Caspase-8表达量没有明显变化,说明花生2s清蛋白通过促发线粒体和内质网调控的细胞凋亡途径来诱导A549细胞凋亡。不涉及死亡受体途径。
本实验研究结果表明,花生2s清蛋白能够诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡,而且诱导凋亡机制是通过线粒体途径和内质网途径,不涉及死亡受体途径。