【摘 要】
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交替糖蔗糖酶（alternansucrase,EC 2.4.1.140,ASR）是GH70家族的四大经典葡聚糖蔗糖酶之一,它可以进行葡萄糖基转移,催化形成具有α-1,3糖苷键和α-1,6糖苷键交替连接的交替糖。交替糖多糖和交替糖寡糖统称为交替糖,聚合度DP为3-10的交替糖称为交替糖寡糖,聚合度DP超过10时则称为交替糖多糖。交替糖独特的键型结构,使其具有优异的特性,应用范围主要涉及食品、纳米科技
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交替糖蔗糖酶（alternansucrase,EC 2.4.1.140,ASR）是GH70家族的四大经典葡聚糖蔗糖酶之一,它可以进行葡萄糖基转移,催化形成具有α-1,3糖苷键和α-1,6糖苷键交替连接的交替糖。交替糖多糖和交替糖寡糖统称为交替糖,聚合度DP为3-10的交替糖称为交替糖寡糖,聚合度DP超过10时则称为交替糖多糖。交替糖独特的键型结构,使其具有优异的特性,应用范围主要涉及食品、纳米科技、医药、化妆品等领域。本研究将Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355来源的ASR基因（asr）在Pichia pastoris中异源高效表达,探究了重组ASR的酶学性质,优化了重组ASR制备交替糖寡糖的工艺,并对交替糖寡糖粗品进行了纯化,获得了高纯度的交替糖寡糖。主要研究结果如下:（1）ASR基因（asr）在P.pastoris中的异源高效表达。构建了重组质粒p PICZαA-asr和p PIC9K-asr,并分别转化两种宿主菌P.pastoris GS115和P.pastoris X33,获得重组工程菌GS115/p PICZαA-asr、X33/p PICZαA-asr、GS115/p PIC9K-asr、X33/p PIC9K-asr。将上述重组菌进行摇瓶发酵96 h,其酶活分别为1.53 U×m L-1、0.96 U×m L-1、2.93 U×m L-1和1.81 U×m L-1。进一步构建了双启动子菌株GS115/p PIC9K-asr-p PICZαA-asr,将重组菌进行摇瓶发酵,其上清ASR的酶活为8.85 U·m L-1,约是GS115/p PIC9K-asr摇瓶水平的3.0倍。（2）ASR重组菌的高密度发酵。将重组菌GS115/p PIC9K-asr和GS115/p PIC9K-asr-p PICZαA-asr分别在3-L发酵罐中进行高密度发酵。重组菌GS115/p PIC9K-asr发酵72 h后,其产酶能力达到最大值,酶活为34.5 U×m L-1,约是其摇瓶水平的11.8倍;重组菌GS115/p PIC9K-asr-p PICZαA-asr发酵105 h后,其产酶能力达到最大值,酶活为145.6 U·m L-1,约是其摇瓶水平的16.5倍。（3）重组ASR酶学性质的研究。研究重组菌GS115/p PIC9K-asr表达的重组ASR的酶学性质,测得其最适p H为6.0,最适温度为50℃;重组ASR在p H 4.5-8.0的范围内放置7 d后仍能保留90%以上的酶活;重组ASR在40℃下,孵育10 h仍然可以维持50%以上的酶活;重组ASR的Km和kcat分别是31.97 m M,0.36 s-1。（4）ASR制备交替糖寡糖最佳受体分子的研究。分别以麦芽糖、葡萄糖、乳糖和海藻糖为受体底物,以蔗糖为供体底物,利用重组ASR制备交替糖寡糖。当以麦芽糖为受体时,生成的交替糖多糖较少,大部分为DP 3-8的交替糖寡糖;当以其他小分子糖为受体时,生成的交替糖寡糖含量较少,大部分是交替糖多糖。可知,麦芽糖对ASR的亲和力更高,因此在后续选择麦芽糖作为受体分子制备交替糖寡糖。（5）优化了重组ASR制备交替糖寡糖的工艺。优化结果如下:在以蔗糖和麦芽糖为底物,控制总量为300 g×L-1（蔗糖和麦芽糖的摩尔比为4:1）、在40℃、p H 5.5、加酶量3U×g-1条件下反应48 h,可生成交替糖寡糖175.96 g×L-1,转化率达到最大值58.65%。（6）对交替糖溶液粗品进行纯化。采用微生物发酵法对交替糖溶液粗品进行纯化,从10株酵母菌株中,筛选到1株S.cerevisiae菌株,采用菌体接种的方式,在30℃,220r×min-1条件下,摇瓶24 h发酵,交替糖溶液中寡糖的纯度由58.7%提升到88.3%。在5-L罐中进行交替糖溶液粗品的纯化放大实验,发酵23 h后,经过后处理,获得了23.2 g×L-1的交替糖多糖粉末、158.8 g×L-1交替糖寡糖粉末。
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