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目的:通过将兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、兔骨髓间充干细胞诱导分化形成的成骨细胞(osteoblast cells,OBs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外共培养,用低粘附培养法构建预血管化三维细胞微球,为血管化组织工程骨的构建提供一种新的策略。方法:(1)兔骨髓间充质干细胞的体外分离和培养:采用全骨髓贴壁法分离、培养、纯化细胞,倒置显微镜下观察细胞形态、增殖情况,拍照记录。(2)兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向的诱导分化:将第2代的兔骨髓间充质干细胞用含成骨诱导剂的培养基连续培养14天,倒置显微镜下观察细胞形态、增殖状况,茜素红染色鉴定成骨细胞。(3)人脐静脉内皮细胞的培养:观察细胞形态、增殖情况,拍照记录。(4)BMSCs细胞微球的构建:细胞悬液以1000个/孔、5000个/孔、10000个/孔、50000个/孔的接种密度接种在超低粘附96孔U型培养板中构建BMSCs微球,接种后的第1,3,7天在显微镜下观察并测量微球直径大小,探索微球大小与细胞接种数量的关系。(5)共培养细胞微球的构建:以50000个/孔的细胞接种密度分别形成BMSCs微球,OBs微球,三种细胞共培养微球(BMSCs:OBs:HUVECs=1:1:1),观察细胞微球形成的过程。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色,检测微球的成骨分化;CD31和DAPI免疫荧光染色和组织学检测,观察细胞微球内微血管官腔结构的形成情况。结果:(1)采用全骨髓贴壁法提取的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形、多角形克隆样生长。(2)BMSCs在成骨诱导剂的作用下,连续诱导14天的茜素红染色结果为阳性,可以观察到橙红色矿化结节。(3)人脐静脉内皮细胞增殖良好,显微镜下的形态特征呈“铺路石样”(4)BMSCs细胞悬液接种于超低粘附U型96孔板后,24h内细胞聚集形成微球,微球直径大小与细胞数量成正比。微球直径随时间的推移逐渐变小,微球聚合更加紧密(5)以50000个/孔的细胞接种密度分别形成的BMSCs微球,OBs微球和共培养微球(BMSCs:OBs:HUVECs=1:1:1),OBs微球直径最小,聚合最紧密;共培养组微球周围细胞排列较松散;微球体外培养到第7天的碱性磷酸酶检测(ALP)和茜素红检测结果表明,成骨微球和共培养微球染色结果呈阳性。第1,3,7天进行的CD31染色,免疫荧光染色镜下可以观察到共培养组微球中HUVEC迁移、聚集、进行性管腔形成的过程。结论:BMSCs在一定条件下可以向成骨细胞方向诱导分化;将BMSCs、BMSCs向成骨细胞方向诱导分化形成的OBs和HUVECs三种细胞共培养,可以体外构建具有血管网络结构的预血管化成骨微球,为血管化骨组织工程的构建提供了一种新的策略。