果皮色泽是梨果重要的农艺性状和商品外观品质之一,也是消费者在购买前先得到的感官感受之一。培育不同果皮色泽的梨果以满足消费者多元化的需求是梨育种的一个长期目标,梨的果皮色泽研究正逐渐成为梨研究的热点。研究褐皮和绿皮梨果皮发育和果皮色泽形成期间的差异表达基因,可以深入理解梨褐皮和绿皮果实的形成机制,推进褐皮和绿皮梨分子育种理论形成和育种工作开展。褐皮梨及其绿皮芽变为梨的果皮色泽研究提供了理想的研究材料。本文首先对黄花梨(果皮为褐色)的绿皮芽变——绿皮黄花进行了生物学特性的研究,其次对比研究了黄花梨和绿皮黄花梨成熟果实果皮结构、表皮膜结构,不同发育时期果点的发育、果皮发育和表皮膜发育,绿皮黄花梨成熟果实不同颜色果锈果皮与黄花梨褐色果皮的特性,然后以确定的黄花梨果皮色泽关键发育期时的两种梨果皮为材料,提取了高分子量RNA,用差异显示PCR (DDRT-PCR)和5’RACE等技术克隆了在黄花梨和绿皮黄花梨果皮中差异表达的梨防御素基因PpyDFN1全长和苯丙氨酸解氨酶基因片段,并对PpyDFN1进行了序列分析和亚细胞定位研究；接着对黄花梨和绿皮黄花梨不同发育时期果皮中参与苯丙烷次生代谢的苯丙氨酸解氨酶基因PpyPAL1、肉桂酸-4-羟化酶基因PpyC4H和肉桂酰CoA氧化还原酶基因PpyCCR表达水平进行了分析,以评估果皮发育期间两种梨果皮中的次生代谢水平差异。最后对PpyDFN1在黄花梨和绿皮黄花梨中的表达特点、转基因烟草中的功能和体外抑菌功能进行了研究。主要研究结果如下。1.绿皮黄花为黄花梨稳定的绿皮芽变,其果皮为绿色,成熟期较黄花梨提前7-10天,果实可溶性总糖、总可溶性固形物和可滴定酸高于黄花梨,果实硬度低于黄花梨,其它植物学特性和结果习性都与黄花梨接近。2.黄花梨与绿皮黄花梨的果点发育明显不同,黄花梨果点形成早而集中,果点发育快,果点大小较同期绿皮黄花梨果点大,而绿皮黄花梨果点形成晚,果点发育慢；黄花梨果面蜡质在花后10周以前较多,花后10周以后果面蜡质不断减少,而绿皮黄花梨果面蜡质从观察开始的花后4周到果实成熟一直存在；黄花梨角质膜花后10周前基本完整,从10周时从果点周围出现裂口到果实成熟时完全龟裂,而绿皮黄花梨果皮角质膜从幼果到果实成熟都保持完整,很少破裂；开花后10周以前,黄花梨与绿皮黄花梨表皮膜都是完整和无色透明的,开花后10周以后,黄花梨角质膜逐渐破裂,直至完全龟裂,裸露的表皮细胞木栓化,表皮膜呈现黄褐色,而绿皮黄花梨表皮膜从幼果到成熟都相对完整,无色透明,其表皮细胞很少木栓化；黄花和绿皮黄花梨果皮结构从外到内依次为角质膜、表皮细胞层和亚表皮细胞层,成熟黄花梨果皮表面粗糙,角质膜不完整,其下或裸露的表皮细胞木栓化,不能被间苯三酚染色,颜色为黄褐色,而成熟绿皮黄花梨果皮表面光滑,角质膜完整,其下表皮细胞为绿色或无色,没有木栓化。成熟黄花梨果实的表皮膜为黄褐色,是果皮颜色的决定者,而绿皮黄花梨果实表皮膜无色透明,不决定果皮色泽。3.绿皮黄花梨的深锈果皮与黄花梨的黄褐色果皮本质上是一样的,而浅锈果皮和深锈果皮的区别主要在于角质膜的受损程度、表皮细胞的木栓化程度和木栓化表皮细胞层的完整性。4.用黄花梨和绿皮黄花梨果皮为材料,建立了一种从果皮中分离高分子量RNA(HMW RNA)和低分子量RNA(LMW RNA)方法。用果皮中所提取的高分子量RNA合成的cDNA作为DDRT-PCR模板,克隆差异片段,结合5’RACE及5’同源简并引物扩增,克隆了黄花梨和绿皮黄花梨果皮中差异表达基因——梨防御素基因PpyDFN1(GenBank登录号为HM044853)和苯丙氨酸解氨酶基因PpyPAL1。实时荧光定量PCR进一步确定了两个基因在8周的黄花梨和绿皮黄花梨果皮中表达量存在差异,其中PpyDFN1在黄花梨果皮中的表达量为绿皮黄花梨果皮中表达量的6.7倍,苯丙氨酸解氨酶基因PpyPAL1在黄花梨果皮中的表达量为绿皮黄花梨果皮中的2.2倍。黄花梨防御素基因PpyDFN1的全长cDNA序列为567bp,包括72bp的5’非翻译区,258bp的3’非翻译区和237bp的编码区。在5’非翻译区含有一个(TC)7简单重复序列。编码区编码一条长度为78个氨基酸残基组成的多肽链,该多肽链的分子量为8.65KDa,等电点为9.36。BLASTP序列分析表明,该多肽链为防御素的前体序列。信号肽预测分析表明,多肽链的前31个氨基酸序列为防御素的信号肽,余下47个氨基酸残基组成的序列为成熟的防御素。梨防御素三维结构的同源比对建模表明,防御素PpyDFN1呈现出典型的由一个α-螺旋,三个反向平行的p-折叠组成的βαββ防御素结构。基因组序列克隆和分析表明,PpyDFN1的基因组序列在黄花和绿皮黄花中没有差异,都含有一个内含子和2个外显子。构建的亚细胞定位载体用于轰击洋葱表皮细胞结果表明,PpyDFN1定位在细胞壁上。5.黄花梨和绿皮黄花梨花后6周到10周的果皮中PpyPAL1、PpyC4H和PpyCCR表达量较高,其中在黄花梨果皮中ppyPAL1和PpyCCR表达量显著高于绿皮黄花梨果皮中的表达量。上述基因高表达量发生时期与果点形成和扩大期吻合,一定程度上反映了此时期果皮中旺盛的次生代谢活动。而黄花梨果皮中PpyPAL1和PpyCCR较高的表达量,反映了黄花梨果皮较绿皮黄花梨果皮中有着更为旺盛的苯丙烷类物资代谢活动。6.梨防御素PpyDFN1在根、叶片、花梗、萼片、花瓣、雌蕊和柱头、雄蕊、种子、果肉和果皮中基础性表达。PpyDFN1基因的表达表现出果点发育时期依赖性,在果点形成和扩大期表达量较高,在果点形成后期表达量较低；PpyDFN1在黄花梨果皮中的表达量总体上较绿皮黄花梨高。机械损伤、乙烯、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和H202都能促进PpyDFN1的表达,而ABA不能。7.表达PpyDFN1的烟草叶片提高了对灰霉菌的抗性；转PpyDFN1基因植株节间缩短,高度降低,开花延迟,花器官较短,花梗较短,花梗较粗,花筒较粗等；表达PpyDFN1基因的T1代转基因幼苗的根系明显短于非转基因对照。用镍离子树脂从转基因植株中纯化了PpyDFN1,纯化的蛋白洗脱液可以抑制农杆菌的生长。