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第一部分:
汉族儿童NKG2-C基因缺失与巨细胞病毒感染相关性研究
目的:本实验通过收集儿童血标本,用不同的检测方法检测外周血基因组中有无NKG2-C基因片段的缺失。确定儿童中NKG2-C基因片段的缺失率,并确定在临床上有感染人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)明显症状的患儿,他们是否存在NKG2-C缺失。为以后巨细胞病毒的诊断与治疗寻找新的方法提供理论基础。
方法:在江苏大学附属人民医院收集104份患儿血液标本,将其分为巨细胞病毒感染组(HCMV+)与非巨细胞病毒感染组(HCMV-)。提取基因组DNA、设计引物、做普通PCR得到NKG2-C的基因片段。用所获得的基因片段样本做琼脂糖凝胶电泳,通过紫外检测仪曝光检测有无相应基因长度的条带显示在琼脂糖胶上。筛选出缺失样本与带有NKG2-C基因的基因组样本作为对照为一组,已做过普通PCR后的NKG2-C基因片段样本为一组,两组都送基因测序公司测序。
结果:在HCMVˉ组中患儿中NKG2-C纯合子缺失大约有4.16%。根据Hardy-Weinberg假设原理,计算出等位基因缺失概率约20.4%。在HCMV+中患儿NKG2-C纯合子缺失大约有50%。两组相比,应用SPSS16.0统计软件,采用卡方检验中Yates校正公式计算出x2=15.9,x2>x20.05,P<0.005,得出两组NKG2-C基因片段的缺失相比差异是有明显统计学意义的结论。
结论:实验研究结果表明容易感染HCMV的儿童可能与其NKG2-C的缺失有关。本实验研究为以后巨细胞病毒的诊断与治疗都提供了理论依据。
第二部分:
肝素酶联合氯酸钠体外抗人巨细胞病毒的作用
目的:研究在体外用肝素酶与氯酸钠干预人胚肺成纤维细胞(Humanembryoniclungfibroblast,HELF),观察人巨细胞病毒感染干预HELF后的细胞病变,为证明细胞表面的硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)与HCMV感染人胚胎成纤维细胞的吸附过程的关系。
方法:1.测定HCMVAD169对HELF的毒力已长成单层HELF细胞培养板中加入10-1-10-7的HCMV病毒悬液,设正常细胞组为对照组,各组设8个复孔。当观察到细胞特征性病变效应(CPE)不再有变化时,记录出现CPE的孔数,按照Reed-Muench法计算半数组织培养感染量(TCID50)。
2.测定氯酸钠对HELF的毒性将不同浓度的氯酸钠分别加入已长成单层HELF细胞培养板中,设5个复孔,同时设不加氯酸钠的HELF为对照组。当倒置显微镜下观察到的细胞病变不再有变化约7天时,用MTT比色法测定每孔的4490值。计算细胞存活率(CSR)、半数中毒浓度(TD50),推算出最大无毒浓度(TD0)。
3.分组并进行荧光定量-PCR检测根据不同的干预方法分为:细胞组(A)、病毒组(B)、氯酸钠组(C)、肝素酶组(D)、联合用药组(E)。提取各组细胞内HCMVDNA,然后对其DNA提取液进行荧光定量-PCR检测。
结果:
1.本实验测得的HCMV对HELF细胞半数感染量(TCID50)=10-4.4/0.1mL。
2.氯酸钠的最大无毒浓度(TD0)为40Mmol/L。
3.B-E组HCMVDNA载量的均值分别为2.0735×106copies/50mg、6.4140×105copies/50mg、6.104×105copies/50mg、1.7370×103copies/50mg。B组与C组、B组与D组、C组与E组、D组与E组HCMVDNA拷贝数比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:氯酸钠与肝素酶都有体外抗巨细胞病毒作用,联合用药比单独用药效果好。进一步证明了细胞表面的硫酸乙酰肝素与HCMV感染人胚胎成纤维细胞的吸附过程有一定的关系。