论文部分内容阅读
白藜芦醇（Resveratrol,RES）是存在于水果和植物中天然酚类化合物。研究表明白藜芦醇具有多种生物医学功能特性,如保护心血管、降低癌症风险等。但目前有关白藜芦醇在皮肤疾病应用方面的研究尚少。最近,有研究表明白藜芦醇可抑制恶性黑色素瘤细胞α-黑色素细胞-刺激素信号通路。但此方面的作用尚未在体内实验及临床应用中得到证实。为探讨白藜芦醇作为黑色素调控因素在色素沉着疾病中的可能作用,我们进行了下列研究工作:第一部分白藜芦醇对培养的HT-144黑色素瘤细胞的抑制及黑色素生成的影响目的:本研究旨在探讨白藜芦醇对体外培养的HT-144黑素瘤细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑色素的形成能力的影响。方法:采用MTT比色法检测细胞存活率和半数抑制浓度(IC50);Western Blot法检测目的基因p-ERK和p-MEK在蛋白水平上的表达情况;采用MTT比色法分析HT-144细胞黑色素的形成及酪氨酸酶活性。结果:MTT法结果显示,不同浓度（1-15μM）白藜芦醇处理可浓度依赖性地抑制HT-144细胞细胞增殖。经不同浓度白藜芦醇处理24小时,HT-144黑色素瘤细胞p-ERK蛋白的表达下降,下降程度随白藜芦醇浓度增高而增高;与此同时,随白藜芦醇浓度增加,HT-144细胞p-MEK1/2表达增高,呈浓度依赖性。酪氨酸酶活性和黑色素含量MTT比色法分析结果显示,1μM、2μM、5μM、10μM、和15μM白藜芦醇组HT-144细胞酪氨酸酶活性较对照组分别下降了30%、45.1%、55.2%、79.4%和85.5%。与此相应,HT-144细胞的黑色素含量较对照组分别下降了22.4%、50.9%、77.7%、88.5%和92.5%。酪氨酸酶活性、黑色素含量变化与白藜芦醇浓度具有量效关系。结论:1在1-15μM浓度范围内,白藜芦醇可剂量依赖性地抑制体外培养HT-144黑色素瘤细胞增殖,ERK信号通路可能在此过程中发挥一定作用;2不同浓度白藜芦醇均可抑制酪氨酸酶活性,而且较低浓度即出现明显抑制;3白藜芦醇通过抑制酪氨酸酶活性抑制黑色素的生成量。第二部分不同浓度白藜芦醇对豚鼠炎症后色素沉着的影响目的:探讨白藜芦醇对实验性豚鼠炎症后色素沉着的影响,评价治疗副反应,为色素性疾病的白藜芦醇治疗提供有效的实验依据。方法:使用15只健康成年豚鼠,剃除豚鼠背部的毛发,暴露皮肤随机分为5个相隔区域,每隔2天,采用CO2点阵激光处理选定区域,然后窄谱中波紫外线（波长311nm）照射,连续3次,建立炎症后色素沉着的实验动物模型。干预前取组织病理检查及VISIA检测。将实验动物分为五组:空白对照组、氢醌组、调Q激光氢醌组、低浓度白藜芦醇组和高浓度白藜芦醇组,每组15只;空白对照组不做任何处理;氢醌组采用2%氢醌乳膏外涂,作为阳性对照;调Q激光组采用Q-开关Nd:YAG激光治疗;白藜芦醇组分别采用低浓度白藜芦醇（白藜芦醇溶液:0.9%氯化钠溶液=1:3,相当于每100ml含白藜芦醇0.25mg,每100ml溶液中加0.5g月桂氮卓酮）和高浓度白藜芦醇（白藜芦醇原液:0.9%氯化钠溶液=1:1,相当于每100ml含白藜芦醇0.5mg,每100ml溶液中加0.5g月桂氮卓酮）进行治疗。氢醌乳膏组:外用,1日2次;调Q激光（能量:4.0J/cm2）组:2周1次;低浓度白藜芦醇组,外涂,1日1次;高浓度白藜芦醇组,外涂,1日1次。各组均连续治疗6周。治疗6周时,再次取治疗区域组织进行病理学和VISIA检测,观察色素沉着的变化,分析不同的方法对豚鼠色素沉着的影响情况。结果:经统计分析,空白对照组、氢醌组、调Q激光氢醌组、低浓度白藜芦醇组和高浓度白藜芦醇组治疗前皮损VISIA图像分析棕色斑测定定量绝对值分别为4.5216±0.5374、4.4143±0.5063、4.5063±0.5646、4.5957±0.6615和4.4211±0.8270。各组间无明显差异（P>0.05）,具有可比性。治疗6周后,棕色斑测定定量结果表明,空白对照组和调Q激光组棕色斑测定定量分别为4.4331±0.5797和4.3617±0.6068,与治疗前无明显变化,而氢醌组、低浓度白藜芦醇组和高浓度白藜芦醇组分别为3.1275±0.6400、3.2169±0.7906和3.2725±1.5399,均明显低于干预前（P均<0.05）。氢醌组、低浓度白藜芦醇组和高浓度白藜芦醇组间无明显差异,但均低于空白对照组和Q-开关Nd:YAG激光组（P均<0.05）。结论:CO2点阵激光与311nm窄谱中波紫外线联合作用可诱导豚鼠皮肤形成稳定的炎症后色素沉着;白藜芦醇对减轻豚鼠皮肤炎症后的色素沉着效果明显,且无明显副作用。低浓度白藜芦醇和高浓度白藜芦醇对色素的影响无明显差别;氢醌乳膏仍为治疗色素性疾病的有效手段,但皮肤刺激现象明显。调Q激光组治疗炎症后色素沉着无效。第三部分白藜芦醇混悬溶液治疗面部黄褐斑的疗效观察目的:通过皮肤镜、VISIA等方法客观评价白藜芦醇混悬溶液外用治疗黄褐斑的临床疗效及其安全性,为白藜芦醇混悬溶液的临床应用提供有效依据。方法:1临床病例选择:选择病变处于稳定期、且皮肤屏障功能完善的黄褐斑患者,无甲状腺疾病、无肿瘤等其他系统性疾病,非孕妇及哺乳期妇女,近1年未使用激素类制剂。参照随机数字表按照1:1产生试验组和对照组。按纳入病例的先后顺序将患者随机分配到试验组或对照组。所有参与治疗患者均签署知情同意书。试验方案经本院医学伦理委员会讨论通过。最后纳入研究50例患者,其中实验组25例,对照组25例。2治疗方法:试验组即白藜芦醇混悬溶液组25例,采用白藜芦醇溶液:维生素E乳:0.9%氯化钠液（2:1:2）外用（相当于每100ml含白藜芦醇0.4mg,每100ml溶液加0.5g月桂氮卓酮）。对照组25例,采用2%氢醌乳膏外用治疗,治疗8周后进行疗效判定。3观察方法:所有患者于初诊、治疗第8周复诊时,记录皮肤镜皮下血管密度情况、VISIA棕黄色颗粒值及血管反应区（红区）、皮损严重程度评分等观察指标;询问用药依从性,记录不良反应。4疗效判定方法:（1）皮损改变评分标准和方法:依据2003年制定的中国中西医结合皮肤性病学会色素性疾病分会的标准。（2）疗效评价标准:按四级疗效标准评定（尼莫地平法）。评分下降指数计算方法:下降指数=治疗前总积分-治疗后总积分)/治疗前总积分。5安全性评价方法:临床治疗全过程观察,记录两组不良反应包括瘙痒、皮肤刺激、皮肤镜血管增生密度的发生情况。6统计学方法:比较各组治疗前后的变化、两组间疗效的比较及不良反应评分采用t检验、Ridit分析;有效率比较采用卡方检验。统计软件为SPSS22.0。结果:1白藜芦醇治疗组和氢醌乳膏对照组治疗前后VISIA棕黄色颗粒定量绝对值的比较白藜芦醇混悬溶液组治疗前后VISIA棕黄色颗粒定量绝对值分别为32.68±9.47和23.82±10.24,治疗后棕黄色颗粒值明显降低（P<0.05）,氢醌乳膏对照组治疗后棕黄色颗粒定量绝对值也可见明显降低（33.65±8.90vs 24.13±6.46,P<0.05）。白藜芦醇混悬液治疗组和氢醌乳膏对照组治疗后棕黄色颗粒测定定量绝对值没有明显差异（23.82±10.24 vs 24.13±6.46,P>0.05）。提示白藜芦醇和氢醌乳膏均可有效降低面部黄斑色素沉着,具有肯定临床疗效,两组没有明显差异。2白藜芦醇治疗组和对照组红区治疗前后VISIA绝对值的比较白藜芦醇混悬液组治疗前后VISIA红区绝对值分别为26.94±9.56和22.52±4.73,治疗后红区绝对值值明显降低（P<0.05）,氢醌乳膏对照组治疗后红区绝对值可见明显升高（25.97±6.52 vs 28.75±5.58,P<0.05）。白藜芦醇混悬液治疗组和氢醌乳膏对照组治疗后红区绝对值分别为22.52±4.73和28.75±5.58治疗组红区数值呈下降趋势,而对照组红区数值呈上升趋势（P<0.01）。提示白藜芦醇治疗无刺激性,不加重炎性反应;氢醌乳膏外用有皮肤刺激反应,炎性反应加重。3白藜芦醇治疗组和对照组治疗后皮损积分变化白藜芦醇混悬液治疗组和氢醌乳膏对照组治疗后皮损积分下降指数均明显改善,治疗组为下降指数为0.66±0.272,对照组下降指数为0.72±0.259,各组治疗前后差异有非常显著统计学意义（P<0.01）,但两组间没有明显差别（P>0.05）,表明两组方法均对黄褐斑治疗有效。4白藜芦醇治疗组和对照组安全性比较:白藜芦醇混悬液治疗组患者治疗期间及治疗后出现瘙痒3例、丘疹3例、红斑3例;氢醌乳膏对照组出现瘙痒8例、丘疹10例、红斑9例。两组间比较经Ridit分析,白藜芦醇混悬液治疗组出现副反应的比率均明显低于氢醌乳膏对照组（P<0.05）。结论:1白藜芦醇混悬液治疗黄褐斑的临床疗效肯定,经VISIA图像分析棕黄色颗粒治疗后明显减少,且红区数值减低,皮肤镜下毛细血管无扩张。2氢醌乳膏治疗黄褐斑,临床疗效肯定,经VISIA图像分析棕黄色颗粒治疗后明显减少,但是部分患者红区数值升高,皮肤镜下毛细血管扩张,显示皮肤有刺激现象。3白藜芦醇混悬液治疗黄褐斑不良反应发生率低、安全性高,可为临床治疗提供思路。