论文部分内容阅读
Dof转录因子是一类高等植物中所特有的转录因子,几乎所有植物中都有发现。Dof转录因子在植物体生长发育过程中具有多种调控功能,如:光信号的传导、激素调节、种子的萌发与生长、植物的抗逆调控等。目前对于Dof转录因子功能研究主要集中在拟南芥中,而对于拟南芥Dof转录因子抗逆功能分析及其调控网络的研究还不充分,因此本文对AtDof2.3转录因子基因的抗逆功能及其调控网络进行研究。通过实时荧光定量RT-PCR技术分析了AtDof2.3基因在拟南芥各组织和盐、干旱、ABA胁迫后的表达模式。结果表明AtDof2.3基因在根中的表达量最低;花序表达量最高,是其在根中表达量的47.43倍;其次是荚果,为根中表达量的46.04倍;茎中表达量为根中的24.81倍,叶中表达量为根中的6.11倍,可见AtDof2.3基因的表达具有明显的组织特异性。NaCl、PEG和ABA胁迫处理后,AtDof2.3基因的表达均表现为上调表达。NaCl胁迫后其表达量为正常生长条件的14.32倍,ABA处理后,表达量增加了27.06倍,PEG胁迫后,其表达量最高(对照的69.46倍)。表明AtDof2.3基因可能参与拟南芥的逆境胁迫应答。为了了解AtDof2.3基因在细胞中主要表达位置,利用基因枪技术将融合基因AtDof2.3-GFP打入洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位分析,结果显示AtDof2.3基因和大部分转录因子基因一致,主要定位于细胞核。酵母双杂交实验结果显示AtDof2.3基因无转录自激活活性。此外,通过酵母单杂交技术对AtDof2.3基因所能识别的元件进行了初步分析。结果显示AtDof2.3基因除了能识别Dof元件(AAAG)外,可能还能识别未知元件(GCAG)。为了进一步研究AtDof2.3基因的抗逆能力,将AtDof2.3基因转入野生型拟南芥(WT)中,比较了过表达AtDof2.3基因拟南芥与野生型拟南芥在NaCl、ABA、Mannitol胁迫后种子的萌发率、幼苗根长及鲜重。结果显示非胁迫条件下,过表达AtDof2.3基因拟南芥与WT无显著差异。而胁迫后,过表达株系萌发率可达到WT的3.87倍,其幼苗根长可达到WT根长的3.12倍,而WT鲜重只为过表达株系的60%。表明过表达AtDof2.3基因拟南芥具有一定的抗逆能力。转基因拟南芥和WT的组织化学染色结果显示,NaCl、ABA和Mannitol胁迫后,过表达株系的DAB、NBT和Evans blue染色都较WT叶片染色颜色浅。进一步的生理指标测定结果显示,过表达株系的SOD活性为WT的4.69倍,POD活性为WT的5.93倍,叶绿素含量为WT的9.91倍,MDA含量只为WT的40%,相对电导率为WT的33.4%。表明AtDof2.3基因可能通过调控植物体生理生化反应以适应不良环境。为了初步了解AtDof2.3基因的上二游调控机制,我们分析了AtDof2.3基因上游启动子序列,发现其含有多种顺式作用元件如IBOXCORE、ARR1TA、GTGANTG10、MYBST1和WRKY71OS等,从中选取.与抗逆相关的Dof元件和ABRE元件进行分析其上游可能的调控基因。利用酵母单杂交技术及农杆菌瞬时转化实验研究发现,AtDof2.1基因能够与AtDof2.3启动子序列的Dof元件结合,AtbZIP40基因能够识别AtDof2.3基因上游ABRE元件。这两个基因可能能通过与AtDof2.3基因上游启动子元件结合从而调控AtDof2.3基因的表达。综上所述,我们初步了解了AtDof2.3基因的抗逆能力及其抗逆调控网络。当植物体处在逆境胁迫中,信号分子能够激活AtDof2.1和AtbZIP40转录因子基因,这些转录因子能够分别与ADof2.3基因上游启动子序列中的Dof、ABRE元件特异结合,从而激活AtDof2.3基因的表达,AtDof2.3基因又能通过调控下游一系列的生理生化过程以适应胁迫环境。