[目的] 人类进入21世纪,感染性疾病仍然是危害人类健康的重要疾患,SARS等新发传染病的暴发和流行构成了严重公共卫生,社会和经济问题。快速、灵敏、特异的检测病原体是预防和控制新发传染病暴发的重要保证。本文的研究目的是建立检测SARS冠状病毒、出血性大肠杆菌O157:H7、霍乱弧菌O139、炭疽芽孢杆菌等四种重要病原体的快速、特异的检测方法,为临床诊断、食品安全检测、环境卫生监测、反恐和出入境检疫等提供有效的检测手段。 [内容] SARS冠状病毒酶联免疫检测方法的建立;SARS冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立;霍乱弧菌O139实时荧光PCR检测方法的建立;大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR检测方法的建立:炭疽杆菌实时荧光PCR检测方法的建立。 [方法] 克隆表达SARS结构蛋白并应用蛋白芯片技术筛选特异抗原,在获得特异抗原基础上,进行SARS冠状病毒双抗原夹心法ELISA试剂的研制,并以SARS阳性和阴性血清作为企业质控品对ELISA试剂进行优化。根据本室专利技术—复合探针荧光定量技术分析原理,以各病原体的特异基因为靶序列,设计合成引物和探针,对相应病原体进行实时荧光定量PCR检测,并探讨核酸提取方法、镁离子浓度、退火温度、探针浓度等因素对定量PCR结果的影响。 [结果] 成功表达M、N、S等结构蛋白及其相应肽段,蛋白芯片筛选结果表明位于N蛋白C末端的N2蛋白的特异性最强,以该蛋白为抗原研制了双抗原夹心ELISA试剂。试剂盒的cutoff值为0.15,检测中检所的特异性标准品(20份阴性血清及18份阳性血清)均合格;检测中检所的灵敏度标准品,64倍稀释后仍为阳性;三批试剂检测的批内、批间变异系数差异均小于5%。试剂盒临床考核结果显示,对442例临床确诊的SARS患者血清样本的平均阳性检出率为70%;对302份SARS康复患者随访血清样本的阳性检出率为76%;对2726例SARS阴性血清样本的检测仅出现2例假阳性反应。 SARS-CoV实时荧光RT-PCR定量检测的最佳镁离子浓度为4mmol/L,退火温度为55℃,退火时间为20s。该方法可检出5拷贝体外转录RNA分子,可对浓度介于10~6copies/μl-10~1copies/μl之间的样品进行准确定量,检测20份阴性血清及20份健康志愿者漱口水结果均为阴性;多次重复检测,Ct值的CV值小于2%。并建立了一种快速、高效的核酸提取方法—磁珠法,并具有操作简便、成本低等优点。对临床确诊的42份SARS病人血清和漱口水标本进行检测,该方法的检出率为79%,与荧光抗体检测法的符合率为70%。 霍乱弧菌O139实时荧光PCR定量检测的扩增体系和扩增条件优化结果:3%