论文部分内容阅读
小头症是一种神经发育障碍,其致病机理和神经损伤机制尚未完全明确,且缺乏有效的治疗措施。小头症最基本的临床表现是头颅周径生长滞后,颅骨形变诱导压应力可直接导致脑组织压缩及神经功能受损,探究压应力调控小头症神经损伤的变化规律对于深刻理解小头症的神经损伤机理和开发有效治疗方法具有重要意义。鉴于人脑发育研究在伦理、检测分析手段等方面的限制,类脑器官由于具有人源特征、3D微环境以及类似大脑的组织结构特征,是探究压应力调控小头症神经损伤变化规律的理想平台。基于此,本论文聚焦小头症中颅骨变形诱导的压应力与神经损伤变化的关系,利用生物力学、神经科学及细胞组织工程手段构建了hi PSC来源类脑器官的小头症可控加载模型,通过设置不同加载梯度探究了压应力与类脑器官生长、接触模量和硬度的关系,以及压应力的传导途径;选取最显著加载间距明确了类脑器官不同脑区的压应力响应规律,评价了小头症特征标志物表达与分布变化。借助转录组分析阐明了压应力调控小头症神经损伤的分子机制。进一步探究了加载再释放和生长因子2种不同方式对损伤类脑器官神经恢复的治疗效果,研究发现加载再释放主要是通过细胞黏附分子及突出引导途径调节压应力神经损伤类脑的细胞重塑和细胞周期,而生长因子可通过PI3K/AKT途径对压应力损伤类脑神经调节,保护神经细胞免受凋亡影响,预示压应力诱导的小头症神经损伤可通过加载再释放及生长因子干预进行有效的治疗。本文主要的研究内容和结论如下:（1）明确了压应力在小头症神经损伤中的作用及调控机制。（1）基于光刻技术及光固化技术制备具有物质交换功能的加载装置,通过设置不同加载梯度探究了压应力与类脑器官生长、接触模量和硬度的关系,随着压应力逐渐增加,类脑生长明显受限,在加载间距为200μm时,类脑面积降低35%,而对于类脑的接触模量及硬度均随压应力增加而增加,且在加载间距为200μm时呈现出显著性差异（p＜0.05）;（2）采用免疫荧光研究了压应力对类脑器官的传导途径,应力促进机械力通道蛋白Piezo1及细胞骨架actin表达,同时β-catenin表达受到抑制,反映出压应力通过机械力通道蛋白及细胞骨架传导及β-catenin蛋白调控类脑生长抑制;（3）选取最显著加载间距明确了类脑器官不同脑区的压应力响应规律,对类脑六个脑区进行了统计分析发现加载类脑总体表达下降31.65%,其中差异最大的是前脑区域,降低了18.81%;（4）评价了小头症特征标志物表达与分布变化,在加载类脑中发现前脑标识蛋白表达异常,前额叶皮质减小,神经祖细胞整体水平表达降低,纺锤体呈现更多的倾斜及垂直方向,同时增殖能力下降,以及新生神经元表达水平降低;（5）借助转录组分析阐明了压应力调控小头症神经损伤的分子机制,压应力促进力学通道蛋白Piezo1基因上调,及细胞骨架Actin表达上升,并通过Wnt通路进行信息传导,引发前额叶皮质受损及紧密连接蛋白下调,最终导致类脑尺寸减小。（2）再释放有助于压应力导致的小头症神经损伤类脑的神经恢复。基于构建的小头症压应力损伤类脑模型,通过选择加载4 d、15 d及20 d进行释放,借助于共聚焦3D成像、免疫荧光、转录组及RT-PCR技术考察了再释放对于小头症类脑的力学传导途径及释放过程中神经恢复机理。（1）再释放利于小头症压应力损伤类脑的生长发育。再释放显著促进类脑生长,类脑生长在细胞水平具体体现在细胞分裂、增殖能力及凋亡水平,再释放会显著提升小头症类脑的前脑区域的有丝分裂水平。再释放对加载类脑神经源性非增殖分裂最为有利,而对于细胞凋亡,再释放会显著降低细胞凋亡水平,同时再释放后小头症类脑的生长是基于细胞骨架、细胞粘附及压应力通道的机械调节,从而引起细胞增殖能力及凋亡水平的变化,最终导致小头症类脑尺寸的增加;（2）再释放利于小头症压应力损伤类脑基底祖细胞的发生及背侧端脑的自我更新。神经分化初期释放的类脑可见较大的空洞及心室表面连续完整,同时提前释放可显著促进背侧端脑标识蛋白PAX6及紧密连接蛋白表达,反映出提前释放提升了背侧端脑自我更新能力;（3）再释放利于小头症压应力损伤类脑神经祖细胞表达及分化。在加载至第4 d释放可观察到与正常类脑相似的神经祖细胞形态变化,在15 d释放可观察到含大量较成熟神经元的突起神经上皮组织,且在神经分化初期释放对于SVZ中间祖细胞表达最显著;（4）再释放促进小头症压应力损伤类脑新生神经元及成熟神经元的生成。在第4 d释放可达到与正常类脑相近的新生神经元数量,同时在15 d及20 d释放新生神经元数量分别提升13.68%和3.83%,而对于成熟神经元,在加载至第4 d,其表达显著下降,但分布与对照组相似,集中在边缘扩增区域;（5）再释放后小头症类脑通过突触引导及细胞黏附调控细胞循环促进细胞增殖。再释放后轴突导向因子SLIT1大量上调,从而激活SRGAP1基因上调,引起下游细胞循环基因CDC14C上调,CDC14C可以有效调节细胞有丝分裂,同时再释放后通过细胞黏附蛋白E-钙粘素进行机械传导,从而促进了胞内细胞骨架Actin表达,并通过β-catenin基因以及轴突导向因子SRGAP1共同调节细胞循环,促进细胞增殖。（3）生长因子有效促进小头症压应力损伤类脑的神经修复。通过免疫荧光染色、3D成像及RT-PCR探究了生长因子在小头症压应力损伤类脑中的神经修复机理。（1）生长因子可有效促进小头症压应力损伤类脑的生长。通过对类脑器官不同时间点的形貌观察发现FGF10在类脑诱导前期具有显著的促进生长的作用,而EGF生长因子在类脑生长中后期表现出显著的促类脑生长的作用,其具体表现在生长因子可显著促进细胞增殖能力,且细胞凋亡水平显著降低,同时可观察到径向胶质纺锤体的方向水平方向分裂,其中分裂末期的细胞占比分别提升至为34.57%及40.46%;（2）生长因子能够改善类脑早期发育。FGF10及EGF生长因子能够促进前脑腹侧标识蛋白NKX2-1及心室区顶尖定位N-cadherin表达,从而改善基底神经分化,形成具有完整的顶端基底极性心室区,在早期加载组类脑中观察到大量的神经祖细胞丢失,而添加FGF10及EGF的类脑中神经祖细胞占比分别为39.08%、32.65%,且分化的神经元更加成熟;（3）生长因子能够有效促进背侧端脑模式形成。小头症的发生背侧端脑是重要的发生区域,通常由该区域的神经祖细胞池减少所造成的。在小头症压应力损伤类脑中观察到PAX6+表达显著降低,而FGF10及EGF可以通过改善径向胶质祖细胞层及粘附连接带,从而达到有效促进背侧端脑模式形成;（4）生长因子可以促进神经元生长及成熟。在小头症类脑前脑区域神经元丢失,而EGF及FGF10的加入会促进前脑区域增长,同时促进前脑区域神经元表达。生长因子的加入对于皮层区域的成熟神经元表达具有显著改善,DCX新生神经元开始从放射向胶质细胞区域向外部迁移,而MAP2+细胞存在于更成熟的神经元中,位于VZs外和组织边缘;（5）FGF10通过PI3K/AKT信号通路对损伤类脑进行神经修复。PI3K/AKT途径可参与细胞生长及增殖的基本进程调控,RT-PCR数据显示出相关通过大量上调,提示FGF10可能与单通道跨膜蛋白Trk A及Trk B结合后,激活PI3K/AKT信号通路,从而调节神经发生,促进神经细胞的增殖分化,保护神经细胞免受凋亡影响。