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背景:牙周软组织的量不足可导致根面龋、牙齿敏感、种植失败等发生,现有的治疗方法在临床应用时仍具有一定的局限性,如何高效、微创地促进牙周软组织的再生与重建是治疗的关键。组织工程学为解决此难题提供了一个新思路。以细胞微球作为组织工程结构的主体,具有供应种子细胞并且本身可作为支架结构的优点,被越来越多地应用于再生医学领域。组织工程结构移植成功的关键在于血管系统的重建,体外预血管化能够促进细胞微球在移植后血管的生成。为使构建的组织工程结构更好地发挥作用,引入新一代血小板浓缩物——液态浓缩生长因子（liquid phase concentrated growth factor,LPCGF）,LPCGF富含多种生长因子,具有促进血管新生和组织再生的作用,其液体形态能够很好地与细胞微球结构结合而方便应用。将LPCGF与共培养细胞联合应用时是否具有促进牙周软组织再生的作用尚无报道。目的:通过体外实验研究在二维培养条件下,LPCGF对牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）单独培养及HGFs+人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）共培养的增殖和迁移的影响。构建LPCGF联合HGFs、HGFs+HUVECs细胞微球结构,通过体内实验探究所组成的结构是否具有促进牙周软组织增量、增进血管的生成的作用。方法:1.采用组织块法培养HGFs,显微镜下观察细胞形态;CCK-8检测细胞增殖能力;免疫荧光化学染色鉴定细胞来源。培养HUVECs。2.制备LPCGF,通过肉眼观察、吉姆萨染色及扫描电镜观察LPCGF的大体形态及结构特征。在二维培养条件下,分析不同浓度LPCGF对HGFs单独培养、HGFs+HUVECs共培养的增殖影响,确定最佳浓度,并观察该浓度的LPCGF对各组细胞水平迁移、垂直迁移的影响。3.低粘附培养法将LPCGF与HGFs单独培养、HGFs+HUVECs共培养细胞构建细胞微球,通过光镜观察形态特征,活/死细胞染色分析细胞微球内部细胞的生存状态。将构建的细胞微球植入裸鼠皮下,术后28天进行HE染色观察细胞微球与周围组织形态,Masson染色观察形成的胶原结构,免疫组织化学染色检测CD31的表达及新生血管情况。结果:1.HGFs原代生长情况良好,细胞呈长梭形或星形的成纤维细胞样。HGFs细胞生长曲线为“S”形,符合细胞正常生长规律。免疫荧光化学染色结果显示,细胞均表达波形蛋白而不表达角蛋白。培养的HUVECs为不规则多边形,呈铺路石子样排列于皿底,生长状态良好。2.离心完成后的LPCGF肉眼观呈淡黄色的液体,具有流动性,室温下放置一段时间后LPCGF会逐渐凝固成凝胶状。吉姆萨染色与扫描电镜显示:LPCGF中由密集的纤维蛋白相互交织,其中有血细胞散在分布。CCK-8增殖实验结果显示:5%LPCGF是促进HGFs及HGFs+HUVECs增殖的最佳浓度,在5%LPCGF的培养条件下,HGFs单独培养细胞增殖能力高于HUVECs+HGFs（P<0.05）。划痕实验结果显示:48 h时,5%LPCGF的单独培养组和共培养组的细胞水平迁移能力大于无LPCGF组（P<0.01=）。在无LPCGF的情况下,共培养组细胞水平迁移能力小于单独培养组,加入5%LPCGF后,共培养组细胞水平迁移能力显著高于单独培养组（P<0.05）。Transwell迁移实验结果显示:5%LPCGF的HGFs单独培养组和HGFs+HUVECs共培养组的垂直迁移能力均高于无LPCGF组（P<0.05）。无论有无LPCGF,共培养组的垂直迁移能力均高于单独培养组（P<0.05）。3.低粘附培养法构建5%LPCGF复合HGFs单独培养细胞及HGFs+HUVECs共培养细胞微球,镜下观察到HGFs组、HGFs+5%LPCGF组以及HGFs+HUVECs组细胞微球边界清晰,HGFs+HUVECs+5%LPCGF组细胞微球体积较大,结构松散,周围有透明的凝胶状结构包裹细胞微球。对各组细胞微球进行活/死细胞染色及光密度分析,各组细胞微球在第7、14天时的球体内部同时存在活细胞与死细胞,且两种状态的细胞均匀分布在细胞微球结构中。5%LPCGF的共培养组的活细胞占比大于无LPCGF的共培养组（P<0.01）。在5%LPCGF条件下,共培养组细胞微球的活细胞占比大于单独培养组（P<0.05）。HE、Masson和免疫组织化学CD31染色结果显示在各组中均能观察到多个细胞微球的结构,单个细胞微球相互聚集,形成更大的细胞微球聚集体,各组形成的胶原无明显差异,LPCGF能够促进HGFs单独培养组CD31表达（P<0.01）。结论:本课题的体外实验研究部分,HGFs、HGFs+HUVECs与LPCGF复合后表现出促进细胞增殖、迁移等良好的生物学效应。在体内实验中LPCGF能够促进HGFs单独培养细胞微球CD31的表达,但各组细胞微球植入后未见其在胶原生成方面存在明显差异。对于使用HGFs、HGFs+HUVECs与LPCGF构建促进软组织增量的组织工程结构需优化和进一步的研究。