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过继免疫治疗可将大量体外扩增、活化的肿瘤抗原特异性免疫效应细胞迅速传递给患者,释放调控宿主免疫反应的细胞因子和补充内源性免疫效应细胞,增强患者的细胞免疫功能,又可选择性地抑制、杀伤肿瘤细胞,是目前治疗恶性肿瘤的一个重要有效的辅助治疗方法。但同时也面临多种因素影响该策略的治疗效果,包括：如何在体外获得足够数量的具有肿瘤杀伤效应的特异性免疫活性细胞,如何促进输注细胞在体内存活、增殖并增强其肿瘤特异性的杀伤活性。
本实验室成功构建的mIL-21-Sp2/0瘤苗细胞,可稳定表达mIL-21。且前期的实验结果也表明了其可在小鼠体内诱导小鼠产生有效的抗肿瘤作用。随着近期IL-21研究的不断深入,其具有的多重的免疫调节功能也越发引起广泛关注。尤其是在促进CD8+T细胞活化增殖,增强CTL细胞的活性及减少抗原特异性淋巴细胞凋亡中的所起的作用。
鉴于上述理论和实验基础,本研究充分利用mIL-21-Sp2/0瘤苗的优势,首先以mIL-21-Sp2/0瘤苗细胞代替肿瘤细胞作为刺激抗原,进行肿瘤特异性CTL的体外培养,以改善原有混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养(mixed lymphocyte tumor cell culture,MLTC)方法中的肿瘤细胞普遍存在免疫原性或抗原递呈能力弱的缺点,为体外诱导特异性效应细胞的增殖提供了新的思路。
其次利用稳态驱动增殖的理论,通过大剂量的环磷酰胺诱导宿主鼠的淋巴细胞急剧减少,借以改善肿瘤细胞诱导的免疫耐受和抑制的微环境,使得输注的效应细胞可以更好地在宿主体内增殖、存活。并且根据在自稳增殖早期接触抗原利于效应细胞形成与维持长期特异性免疫记忆能力的观点,在过继肿瘤特异性淋巴细胞的同时再给予mIL-21瘤苗免疫,以期提高过继免疫治疗的抗肿瘤效果。并通过对过继细胞在小鼠体内分裂增殖情况、杀伤功能的检测和亚群表型变化的分析,对其机制进行了探讨。
第一部分mIL-21瘤苗免疫致敏的同系鼠淋巴细胞过继荷瘤鼠的抗肿瘤效应
目的：筛选表达mIL-21的单克隆瘤苗细胞株,观察使用mIL-21瘤苗免疫小鼠的脾及淋巴结淋巴细胞过继荷瘤鼠的抗肿瘤效果。
方法：采用G-418加压、有限稀释法获取表达mIL-21细胞株并经RT-PCR鉴定。筛选出的瘤苗细胞接种小鼠,一周后取小鼠脾及淋巴结的淋巴细胞,尾静脉过继同系Sp2/0细胞致瘤的荷瘤鼠,观察肿瘤的生长情况及小鼠存活期。结果：筛选的mIL-21瘤苗细胞的RT-PCR检测结果表明有mIL-21基因表达,其免疫小鼠的淋巴细胞过继给同系荷瘤宿主,可见一定的抗肿瘤活性,肿瘤生长及存活期等观察指标优于其它对照组。
结论:mIL-21-Sp2/0瘤苗细胞免疫小鼠的淋巴细胞过继至荷瘤宿主体内可产生一定的抗肿瘤免疫应答,可用作过继免疫治疗的效应细胞。
第二部分:mIL-21瘤苗细胞体外对鼠肿瘤特异性淋巴细胞增殖及功能的影响
目的：研究表达mIL-21的Sp2/0细胞与以灭活Sp2/0细胞预先免疫小鼠的淋巴细胞体外共培养,是否对预致敏淋巴细胞增殖及功能有影响。
方法：获取灭活Sp2/0细胞免疫小鼠的淋巴细胞,在mIL-2存在的条件下,以mIL-21转染的Sp2/0细胞为刺激细胞,用流式细胞术(FCM),检测CFSE标记的淋巴细胞增殖和7-AAD标记的细胞毒活性；用ELISpot法确定分泌IFN-γ的淋巴细胞数量。
结果：转染mIL-21的Sp2/0细胞对预致敏的淋巴细胞增殖有明显影响,活化的淋巴细胞对靶细胞的杀伤率与对照组相比有显著增加,达35.57±4.72％(p<0.05),且分泌IFN-γ的细胞数量明显增加。活化增殖后的淋巴细胞回输至环磷酰胺预处理的小鼠,能产生针对该肿瘤细胞良好的保护作用,延长小鼠的成瘤时间。
结论：表达mIL-21的Sp2/0细胞在体外可有效促进肿瘤抗原特异性淋巴细胞活化及增殖,并增强其对肿瘤细胞的杀伤功能。
第三部分：过继肿瘤特异性淋巴细胞联合mIL-21瘤苗免疫抗肿瘤效应的研究
目的：探讨环磷酰胺(Cy)诱导小鼠淋巴细胞减少的状态下,过继mIL-21转染的瘤苗细胞(mIL-21-Sp2/0)免疫致敏的同系小鼠肿瘤抗原特异性淋巴细胞,并联合mIL-21-Sp2/0瘤苗免疫抗肿瘤效应的机制。
方法：Cy处理BALB/c小鼠,末次注射两天后,以灭活mIL-21瘤苗免疫的同系小鼠的脾及淋巴结的淋巴细胞做为肿瘤抗原特异性淋巴细胞过继,同时用mIL-21瘤苗免疫,7 d后以野生型Sp2/0细胞攻击,观察小鼠的肿瘤生长情况。FCM分析CD4+、CD8+、CD4+CD25+T细胞亚群的变化,分别以CFSE和7-AAD标记,FCM检测淋巴细胞增殖能力和效应细胞的细胞毒活性,ELISpot检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的数量。
结果：与对照组相比,Cy预处理的小鼠接受过继效应细胞联合mIL-21瘤苗免疫可有效的抵抗野生型Sp2/0细胞的攻击。过继的肿瘤特异性淋巴细胞的体内增殖能力和体外杀伤活性显著增强,分泌IFN-γ的效应细胞的数量显著增高。
结论：在淋巴细胞减少期过继mIL-21瘤苗致敏的肿瘤抗原特异性淋巴细胞并同时给予mIL-21瘤苗免疫,利于输入的效应细胞及自身免疫细胞的增殖和特异性抗肿瘤功能的形成与维持。