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α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)是帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)的核心病理物质,α-syn在神经细胞间的传递是疾病发展的重要病理机制,α-syn的胞外分泌是其传递的核心环节,但目前关于干预α-syn外分泌的药物研究报道尚较少见。黄芩素(Baicalein,BAI)是中药黄芩的活性成分,能与α-syn分子结合、抑制其异常聚集、降解其聚集体及减轻其细胞毒性作用,但在干预α-syn外分泌方面的研究报道不多。我们猜测BAI很有可能能够阻断α-syn的外分泌。为此,本研究运用慢病毒转染的方法构建稳定过表达α-syn SN4741多巴胺能神经细胞系,并以之为实验模型,探讨BAI对α-syn外分泌的阻断作用。目的:1、建立过表达野生型(WT)和A53T突变型α-syn SN4741稳转细胞系。2、探讨BAI对α-syn外分泌的阻断作用。方法:1、首先,通过PCR技术从cDNA中扩增编码人源WTα-syn的SNCA-WT基因编码区全长片段,将之插入pIRES2-EGFP中,并以之为中间载体,对SNCA-WT基因片段进行A53T点突变,构建SNCA-A53T基因片段。其次,分别将SNCA-WT和SNCA-A53T插入到pLVX-IRES-PURO中,构建p LVX-SNCA-WT-IRES-PURO和p LVX-SNCA-A53t-ires-puro两个慢病毒质粒载体,同时,构建plvx-egfp-ires-puro作为对照。再次,分别将上述3种载体与包装质粒共转染293t细胞,进行慢病毒包装。分别用携带snca-wt、snca-a53t和egfp基因的慢病毒感染正常sn4741细胞。最后,以puromycin筛选阳性细胞,从而分别构建过表达wtα-syn、a53tα-syn或egfp的sn4741稳转细胞系。2、分别用不同浓度bai处理正常sn4741细胞,6h、12h、24h后mtt法检测各组细胞活力,以筛选bai的合适作用剂量供后续实验使用。3、以bai分别处理正常和过表达egfp、wtα-syn或a53tα-synsn4741细胞(分别为正常+bai组、egfp+bai组、wt+bai组、a53t+bai组),同时设立同基因型对照组(分别为正常组、egfp组、wt组、a53t组),6h、12h、24h后westernblot分别检测各组细胞内和培养液(cm)中α-syn含量、细胞内与α-syn外分泌相关的标志蛋白flotillin-1、lamp-1及胞内降解相关的标志蛋白lc3和lamp2的含量,以探讨bai对α-syn外分泌的阻断作用及机制。结果:1、测序结果显示,snca-wt、snca-a53t和egfp基因序列正确;qpcr结果显示,感染携带snca-wt或snca-a53t基因的慢病毒的sn4741细胞内snca表达显著升高;荧光显微镜观察感染携带egfp基因的慢病毒的sn4741细胞,可见egfp表达。2、mtt结果显示,与norm组比较,bai处理6h后,除1μm组和3μm组外,各bai处理组细胞活力均显著增高(p<0.01);bai处理12h后,所有bai处理组细胞活力均显著增高(p<0.01);bai处理24h后,仅200μm组和400μm组细胞活力显著增高(p<0.01)。3、与同基因对照组比较,bai处理6h及以上,wt+bai组和a53t+bai组cm中α-syn含量均显著减少,而其细胞内α-syn含量则在bai处理6h和12h后增高,24h后下降,除wt+bai组12h亚组接近有统计学意义外(p≈0.063),余bai处理组均有统计学意义。与同基因型对照组比较,bai处理24h,各基因型sn4741细胞内flotillin-1水平均降低,其中,正常+bai组、wt+bai组有统计学意义,egfp+bai组接近有统计学意义(p≈0.060),a53t+bai组无统计学意义。此时,正常+bai组、egfp+bai组、wt+bai组细胞内lamp1水平亦下降,但均无统计学意义。与同基因型对照组比较,bai处理6h后,a53t+bai组细胞内lc3b含量下降,差异有统计学意义;bai处理12h后,正常+bai组、a53t+bai组细胞内lcb均下降,差异有统计学意义;BAI处理24h后,各BAI处理组细胞内LC3B含量均下降,除WT+BAI组差异无统计学意义外,余BAI处理组均有统计学意义。与同基因型对照组比较,BAI处理6h后,正常+BAI组、EGFP+BAI组细胞内LAMP2含量增高,WT+BAI组、A53T+BAI组含量下降,其中,正常+BAI组、A53T+BAI组有统计学意义;BAI处理12h和24h后,各BAI处理组细胞内LAMP2含量均下降,其中,EGFP+BAI组12h亚组、WT+BAI组24h亚组、A53T+BAI组12h和24h亚组均有统计学意义。结论:1、成功构建了过表达EGFP、过表达WTα-syn和A53Tα-syn等3个SN4741稳转细胞系。2、确定以100μM BAI作为后续实验的作用剂量。3、BAI可减少过表达WT/A53Tα-syn SN4741细胞CM中α-syn水平,使其胞内α-syn水平在处理早期增高,后期下降,降低其胞内与α-syn外分泌相关的蛋白Flotillin-1及与其胞内降解相关的蛋白LC3B、LAMP2的水平,但对LAMP1影响不显著,提示BAI对α-syn外分泌可能具有阻断作用。