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[目 的]检测溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)不同疾病严重程度情况下肠上皮细胞线粒体自噬水平,在临床水平初步探索肠上皮细胞线粒体自噬与UC的相关性及潜在调控机制。在动物及细胞水平,探索热休克转录因子2(Heat shock transcription factor 2,HSF2)通过调控肠上皮细胞线粒体自噬而影响NLRP3炎症小体激活的潜在机制。为进一步阐明HSF2及肠上皮细胞线粒体自噬在UC中的作用提供理论依据,为寻找UC新的治疗靶点奠定基础。[方法]本研究分为临床、动物、细胞三个部分:第一部分:临床水平:1、根据我国关于炎症性肠病诊疗共识意见,选取90例UC患者,其中轻度、中度、重度患者各30例,同时选取以结肠癌筛查为目的的健康对照者60例,进行临床研究。各组患者均行结肠镜检查,并于固定部位取材。取材后利用透射电镜观察各组肠粘膜组织内肠上皮细胞线粒体形态及线粒体自噬现象,初步判断肠上皮细胞线粒体自噬与UC疾病严重程度的相关性;2、利用免疫组化及RT-PCR检测上述各组肠粘膜组织内线粒体自噬关键通路PARL/PINK/Parkin变化情况,同时利用免疫荧光检测上述各组肠粘膜组织内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,探索UC肠上皮细胞线粒体自噬的潜在作用与调控机制。第二部分:动物水平:1、选用SPF级C57BL/6小鼠进行动物实验。其中,利用课题组前期稳定建系的hsf2-/-作为基因敲除小鼠。将小鼠按照是否基因敲除首先分为野生型组(WT组,20只)与基因敲除组(KO组,20只),利用RT-PCR及Western blot验证hsf2基因敲除效果。然后利用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)造模,将野生型组与基因敲除组在组内随机分为野生型饮水组(WT+H2O组,10只)、野生型饮DSS组(WT+DSS组10只)、基因敲除饮水组(KO+H2O组10只)及基因敲除饮DSS组(KO+DSS组10只)。WT+H2O组及KO+H2O组连续饮用蒸馏水7天,WT+DSS组及KO+DSS组连续饮用含有3%的DSS的蒸馏水7天。于造模第八天处死小鼠,获取小鼠结肠标本。2、评估各组小鼠DAI评分及结肠缩短程度,并利用HE染色评估各组小鼠病理组织学评分;3、利用透射电镜观察上述各组小鼠肠粘膜组织内肠上皮细胞线粒体形态及线粒体自噬现象;4、运用RT-PCR、免疫组化、Western blotting及免疫荧光技术,分别检测上述各组小鼠肠粘膜组织内线粒体自噬关键通路PARL/PINK/Parkin、ROS及NLRP3炎症小体表达情况;5、ELISA检测各组小鼠血清IL-1β及IL-18表达水平;6、在动物水平评估hsf2与上述检测指标的相关性并探索潜在的调控机制。第三部分:细胞水平:1、运用慢病毒转染方法,过表达或敲除Caco-2细胞内HSF2,改变HSF2基因及蛋白水平;利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)及三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)刺激Caco-2细胞,模拟炎症环境;根据上述处理,将细胞分组:正常对照组(NC)、炎症刺激对照组(NC+LPS+ATP)、炎症刺激过表达HSF2组(OV-HSF2+LPS+ATP)、炎症刺激过表达HSF2阴性对照组(OV-NC+LPS+ATP)、炎症刺激敲除 HSF2 组(shR-HSF2+LPS+ATP)、炎症刺激敲除HSF2阴性对照组(shR-NC+LPS+ATP);2、利用透射电镜观察上述各组细胞内线粒体形体及线粒体自噬水平差异;3、运用RT-PCR、流式细胞技术、免疫组化及Western blotting,分别检测上述各组细胞内线粒体自噬关键通路PARL/PINK/Parkin、ROS水平及NLRP3炎症小体表达情况;4、ELISA法检测上述各组细胞上清内IL-1β及IL-18表达水平。[结 果]第一部分:临床水平:1、与健康对照者相比,UC患者肠上皮细胞内出现更多形态异常的线粒体,线粒体自噬现象显著增加;同时,随着UC疾病严重程度的增加,UC肠上皮细胞内形态异常线粒体数量逐渐增多,线粒体自噬水平逐渐升高。2、与健康对照者相比,UC患者肠粘膜组织内ROS水平显著升高,PARL的基因及蛋白表达下降,PINK/Parkin的基因及蛋白表达增加;同时,随着UC疾病严重程度的增加,UC肠粘膜组织内ROS水平逐渐升高,PARL的基因及蛋白表达逐渐下降,PINK/Parkin的基因及蛋白表达逐渐增加,各组间差异具有统计学意义。第二部分:动物水平:1、DSS成功诱导小鼠结肠炎模型。对比各组,KO+DSS组小鼠DAI评分最高、结肠缩短程度最明显,HE染色提示KO+DSS组小鼠结肠组织结构破坏最显著,炎症反应最剧烈,病理评分最高。各组间差异具有统计学意义。2、DSS造模后,小鼠肠上皮细胞线粒体自噬水平增加;其中,KO+DSS组肠上皮细胞线粒体自噬水平较WT+DSS组下降。各组间差异具有统计学意义。3、DSS造模后,PARL的基因及蛋白表达下调,PINK/Parkin的基因及蛋白表达升高,肠粘膜内ROS水平增加,NLRP3炎症小体表达上调。其中,与WT+DSS组相比,KO+DSS组PARL的基因及蛋白表达较高,PINK/Parkin的基因及蛋白表达较低,ROS水平及NLRP3炎症小体表达则更高。各组间差异具有统计学意义。4、DSS造模后,小鼠血清IL-1β及IL-18水平升高。其中,与WT+DSS组相比,KO+DSS组血清IL-1β及IL-18水平更高。各组间差异具有统计学意义。第三部分:细胞水平:1、慢病毒转染调控了 Caco-2细胞内HSF2基因及蛋白水平;2、加入LPS及ATP刺激细胞后,可诱发细胞线粒体自噬;透射电镜观察发现,炎症刺激过表达HSF2组(OV-HSF2+LPS+ATP)与炎症刺激对照组(NC+LPS+ATP)及炎症刺激过表达HSF2阴性对照组(OV-NC+LPS+ATP)相比,存在更明显的线粒体自噬现象。反之,炎症刺激敲除HSF2组(shR-HSF2+LPS+ATP)线粒体自噬水平较炎症刺激对照组(NC+LPS+ATP)及炎症刺激敲除HSF2阴性对照组(shR-NC+LPS+ATP)更低。提示在Caco-2细胞内,HSF2可能与线粒体自噬水平正相关。3、过表达HSF2可以抑制PARL基因及蛋白表达,促进PINK/Parkin基因及蛋白表达,减少Caco-2细胞内ROS含量,抑制NLRP3炎症小体激活,降低IL-1β及IL-18表达水平;反之,敲除HSF2可提高PARL基因及蛋白表达,抑制PINK/Parkin基因及蛋白表达,提高细胞内ROS含量,促进NLRP3炎症小体激活,升高IL-1β及IL-18表达水平。[结论]1、在UC患者中,肠上皮细胞受损线粒体数量及线粒体自噬水平随UC疾病严重程度的增加而升高,肠粘膜组织内ROS亦随之升高。PARL/PINK/Parkin信号通路可能在UC肠上皮细胞线粒体自噬中发挥重要作用。2、低hsf2水平可抑制DSS诱导的小鼠结肠炎模型中肠上皮细胞线粒体自噬,导致小鼠肠粘膜组织内ROS增加,NLRP3炎症小体及促炎细胞因子表达增加,炎症反应更加剧烈。提示hsf2可能在动物水平与肠上皮细胞线粒体自噬水平正相关。其次,hsf2可能通过PARL/PINK/Parkin通路调控小鼠肠上皮细胞线粒体自噬,发挥调控DSS小鼠结肠炎模型肠道炎症的作用。3、HSF2与Caco-2细胞线粒体自噬水平正相关,并能通过PARL/PINK/Parkin通路促进Caco-2细胞线粒体自噬,促使在炎症环境下受损的Caco-2细胞线粒体更快地通过线粒体自噬被清除,从而降低细胞内ROS水平,抑制NLRP3激活程度,最终减少促炎细胞因子释放,抑制炎症反应,发挥保护性作用。