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背景及目的:氨基甙类抗生素在临床上应用较为广泛,但由于其耳毒性作用给不少患者造成听及前庭功能损害,其耳毒性作用的真正机制至今仍不清楚,耳毒性药物所致听及前庭功能损害的治疗也是当今世界耳科的难题之一。研究表明,Caspase-3蛋白酶与细胞凋亡密切相关,凋亡可能就是蛋白酶级联切割的过程。在蛋白酶级联切割过程中Caspase-3处于核心位置,可能发挥非常重要的作用,Caspase-3是凋亡的执行者。Bcl-2家族是最重要的凋亡调节基因之一,Bcl-2家族可调节cyto-c的释放,从而调节cyto-c介导的caspase的活化。Caspase家族和Bcl-2家族在细胞凋亡中起着非常重要的作用。最近有学者用庆大霉素连续注射造成豚鼠前庭系损伤,发现细胞凋亡是内耳前庭感觉毛细胞损伤的一种重要方式,但细胞凋亡是否也是卡那霉素对耳蜗系统慢性损害的一种方式,且用药后不同时间耳蜗细胞发生凋亡及机制的动态时相变化规律尚未见报道。有研究表明钙拮抗剂能减轻AmAn耳毒性,但其是否是通过减轻凋亡发生而起到预防保护的作用尚不清楚。本研究旨在通过卡那霉素耳慢性中毒模型,应用TUNEL原位杂交技术、荧光染色法、电镜技术检测凋亡是否是卡那霉素对耳蜗慢性损害的一种方式,探讨Caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相关分子在卡那霉素耳慢性中毒及应用钙拮抗剂治疗后不同时间耳蜗细胞凋亡中的改变,采用激光共聚焦检测钙拮抗剂应用前后对卡那霉素耳慢性中毒耳蜗细胞凋亡各时相点细胞内钙的变化情况,从而探讨卡那霉素耳慢性中毒诱发的耳蜗细胞凋亡机制,为临床防治AmAn耳毒性导致的感音神经性聋提供实验依据。 方法:选用体重250~300g健康白色红目豚鼠126只,随机分为:①卡那霉素耳中毒组:豚鼠于后腿内侧肌肉注射硫酸卡那霉素200mg/kg/d,连续给药14天:②钙拮抗剂尼莫地平治疗组:豚鼠注射硫酸卡那霉素 20omg瓜g/d的同时,灌胃法给药20mg/kg/d,连续给药14天;③正常对照组:生理盐水等量肌肉注射,连续14天。卡那霉素耳中毒组及治疗组分别于停药后第1天、3天、7天及14天处死各组动物,分别观察ABR、TUNEL、耳蜗毛细胞核荧光染色、Caspase一3、Bax、Bcl一2、耳蜗基底膜毛细胞C扩+浓度、HE、透射电镜等各项指标。 结果: 1.电生理改变:卡那霉素耳慢性中毒豚鼠听闭随观察时间延长逐渐升高,钙拮抗剂治疗组听力损害减轻,随观察时间延长听闭也有轻度升高。 2.TUNEL:卡那霉素耳慢性中毒后3天,耳蜗细胞开始出现染色阳性细胞,与对照组相差显著(P<0.05),随观察时间延长,阳性细胞数量增多,且染色加深,7、14天组与对照组相差高度显著(P<0.01);钙拮抗剂尼莫地平治疗后TUNEL染色变浅,治疗3天组较卡那霉素3天组相差显著(P<o,05),治疗7、14天组较卡那霉素7、14天组相差高度显著(p<0.01)。卡那霉素14天组外毛细胞、内毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞、血管纹细胞TUNEL阳性细胞数,愈近底回愈多,愈近顶回则愈少;钙拮抗剂尼莫地平治疗14天组,TUNEL染色变浅,两组动物各蜗回TUNEL阳性细胞数则是卡那霉素组显著大于钙拮抗剂尼莫地平治疗组(P<0.01)。 3.CasPase一3蛋白表达的变化:卡那霉素1天组Corti器及血管纹、螺旋神经节细胞的Caspase一3蛋白与对照组相差显著(P<0.05),3天、7天和14天组与对照组相差高度显著(P<0.01);钙拮抗剂治疗后染色均明显减弱,治疗3天组较卡那霉素3天组相差显著(P<0.05),治疗7、14天组较卡那霉素7、14天组相差高度显著(P<0.01)。卡那霉素14天组Corti器及血管纹、螺旋神经节细胞的Caspase一3染色阳性细胞数,愈近底回愈多,愈近顶回则愈少;两组动物各蜗回阳性细胞数则是卡那霉素组显著大于钙拮抗剂尼莫地平治疗组(P<0.01)。 4.Bcl一2、Bax蛋白表达的变化:卡那霉素停药后1天、3天、7天和14天Corti器、SG、SV的各种细胞中均可检测到Bax和Bcl一2蛋白。卡那霉素组Bax染色增强,阳性细胞以14天组最多,钙拮抗剂尼莫地平治疗 后Bax染色变浅;卡那霉素组Bcl一2染色明显降低,以14天组最为显著,治疗组相对卡那霉素组Bcl一2染色增强。卡那霉素1天组Corti器、血管纹及螺旋神经节细胞Bax、Bcl一2蛋白与对照组相差显著(P<0.05),3天、7天和14天组与对照组相差高度显著(P<0 .01);钙拮抗剂治疗3天组较卡那霉素3天组相差显著(P<0.05),治疗7、14天组较卡那霉素7、14天组相差高度显著(P<0.01)。越接近底转,Bax和Bol一2变化越明显,凋亡加重与Bd一2减少和Bax的增加一致;钙拮抗剂治疗组的Bax/B cl一2值在三转的Corti器、SG、SV中低于卡那霉素组。 5.荧光染色及电镜:卡那霉素耳慢性中毒后第3可见染色质边聚、核固缩等凋亡形态学改变,随时间延长而进一步加重,用药后14天最严重;治疗组病变较轻,14天未发现凋亡小体形成。 6.耳蜗细胞钙浓度观察:卡那霉素耳慢性中毒后1天耳蜗细胞内游离钙浓度升高,至3、7及14天逐渐升高;钙拮抗剂治疗后耳蜗细胞内游离钙浓度均明显减少。这些变化与前面观察到的听力损失、Caspase一3、Bax及Bcl一2激活是基本一致的,但比毛细?