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多囊蛋白-1（PC-1）是分布于细胞膜的一种跨膜蛋白,属于多囊蛋白家族,分布广泛,主要表达于上皮细胞,在血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和内分泌细胞中也有表达。PC-1的功能众多,可以与多种蛋白结合或相互作用,参与细胞之间及细胞与基质之间的粘附,同时在多条信号通路中发挥重要的作用。PC-1在正常肾脏发育过程中起着重要的作用,ADPKD与PC-1有着密切的关系,约85%的ADPKD的患者是由于PKD-1变异导致的PC-1表达或功能异常引起的。ADPKD还有一些其他系统的病变,目前的研究主要集中于心血管系统,主动脉夹层就是就是其主要的并发症之一。主动脉夹层是一种极其凶险的疾病,目前病因尚不清楚。目前研究表明,主动脉中层的VSMC与夹层的发生有着密切的关系,主动脉夹层患者中层的VSMC存在着不同程度的减少及表型改变。主动脉血管壁VSMC的表型改变目前被认为是一种重要的主动脉夹层发生的分子基础。国外学者在研究中发现,敲除小鼠的PC-1基因会导致小鼠主动脉壁产生壁间血肿等类似主动脉夹层前期的结构改变的情况。我们自己的前期研究也显示,主动脉夹层患者主动脉血管壁的PC-1的表达降低。主动脉夹层的发生与VSMC表型的改变关系密切,因此,我们通过本课题研究在观察夹层主动脉血管壁与正常血管壁PC-1表达差异的同时,设计了细胞实验,探索PC-1降低与VSMC表型改变的关系,同时研究这种以及这种关系的具体作用机制,及PC-1发挥这种作用具体作用位点。第一部分:PC-1在主动脉夹层患者临床标本中表达情况的研究目的:观察主动脉夹层血管壁与正常血管壁的PC-1表达差异方法:分别于术中采集主动脉夹层患者升主动脉血管壁及冠心病患者升主动脉血管壁各4例,分成AD组和对照组,两组年龄性别等无显著差异。选取部分进行固定,HE染色,观察主动脉壁的形态;Masson染色观察血管壁中胶原蛋白的差异;免疫组化染色及western blot检测血管组织中PC-1的含量;RT-PCR检测两组PC-1的m RNA的表达。结果:（1）HE染色病理观察,AD组的主动脉壁三层结构不清晰,中层相对较薄,外膜相对增厚,中层分离,中层的平滑肌细胞排列紊乱,部分区域平滑肌细胞消失,箭头表示区域可见囊性坏死;（2）AD组主动脉血管壁的胶原蛋白明显增多,排列紊乱,平滑肌细胞明显减少,大量的胶原蛋白沉积于平滑肌细胞之间;（3）免疫组化染色显示,对照组与AD组的主动脉血管壁进行免疫组化染色,PC-1被染成棕黄色颗粒。可以看出,棕黄色的阳性颗粒主要聚集在中层VSMC的细胞浆内,对照组中层的VSMC细胞普遍染成黄色,,而AD组的阳性细胞明显减少;（4）Real-time PCR检测结果显示,对照组与AD组PC-1的m RNA表达不同,夹层组的PC-1的m RNA表达量显著低于对照组的表达量（p<0.05）;（5）Western blot检测结果显示,PC-1在对照组和AD组的主动脉血管壁组织中表达不同,AD组的PC-1的表达量显著低于对照组（p<0.05）。结论:主动脉夹层患者主动脉血管壁PC-1的含量及m RNA表达量均明显降低第二部分:PC-1表达下调对VSMC表型的影响目的:研究敲低PC1表达对体外VSMC细胞表型的影响。方法:将购买的人VSMC细胞系进行培养,应用RNAi技术,转染干扰组的VSMC细胞,利用RT-PCR及Western blot检测干扰的效果。再利用cck-8法检测两组的细胞的增殖情况;流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期的变化;Transwell法检测两组细胞迁移能力的变化;Western blot及RT-PCR检测两组VSMC收缩型标志物含量及m RNA的变化。结果:（1）转染效果的检测,根据q RT-PCR检测结果与Western blot检测结果可以看出,干扰组（LV-PC-kd组）与对照组相比,PC-1的m RNA及蛋白表达均明显下降,干扰效果良好。（2）细胞增殖的检测,采用CCK-8法检测对照组与干扰组的VSMC细胞增殖的变化。72小时后,干扰组VSMC的增殖能力明显强于对照组。（3）细胞周期的检测,采用流式细胞术检测对照组与干扰组的VSMC细胞周期的变化。可以看出,干扰组的G0/G1期细胞明显少于对照组,而G2/M期细胞明显多于对照组（p<0.05）。（4）细胞转移能力的检测,采用transwell法检测对照组与干扰组的VSMC细胞转移能力的变化。通过显微镜观察,干扰组迁移到地膜的VSMC细胞明显多于对照组（图2-6）,细胞计数的结果显示,干扰组的细胞转移细胞数明显多于对照组（p<0.05）。（5）VSMC收缩型标志物的检测,平滑肌22α蛋白（smooth muscle 22 alpha,SM22α）、平滑肌肌动蛋白α2（Alpha-Smooth Muscle Actin,ACTA2）、调宁蛋白1（Calponin 1,CNN1）,是收缩型VSMC表达一些特异性的蛋白。RT-PCR结果显示,干扰组的SM22α、ACTA2、CNN1的m RNA表达明显低于对照组;Western blot检测结果显示,干扰组的SM22α、ACTA2、CNN1的蛋白表达明显低于对照组（p<0.05）。结论:PC-1的表达降低可以引起人VSMC的表型向合成型转化。第三部分:PC-1引起VSMC表型改变的信号通路的研究目的:从与PC-1相关的常见通路着手,研究参与PC-1引起VSMC表型改变过程的信号途径。方法:将购买的人VSMC细胞系进行培养,分为两组,一组不进行任何处理,为对照组,另外两组均应用RNAi技术,转染干扰组的VSMC细胞,利用RT-PCR及Western blot检测干扰的效果。利用Western blot检测检测两组细胞中通路蛋白p38、JNK、PI3K、ERK和MEK的磷酸化情况。再将干扰组的一部分VSMC细胞用抑制剂SCH772984处理。利用再利用cck-8法检测三组的细胞的增殖情况;流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期的变化;利用Western blot检测VSMC收缩型标志物含量的变化。结果:（1）通路蛋白的表达情况检测了与PC-1相关的几条通路蛋白的磷酸化水平,与对照组比较,干扰组p38,JNK and PI3K的磷酸化没有明显变化,而ERK和MEK的磷酸化水平明显升高（P<0.05）;Myc与Cyclin D1是MEK/ERK通路的下游蛋白,检测这两种蛋白的表达发现,与对照组比较,干扰组的Myc与Cyclin D1表达量明显升高（P<0.05）。（2）细胞增殖能力的检测,采用CCK-8法检测Ctrl组、LV-PC1-kd+DMSO组和LV-PC1-kd+Comp组的VSMC细胞增殖的变化。72小时后,我们发现,LV-PC1-kd+DMSO组VSMC的增殖能力明显强于LV-PC1-kd+Comp组（P<0.05）。（3）细胞周期的检测,采用流式细胞术检测Ctrl组、LV-PC1-kd+DMSO组和LV-PC1-kd+Comp组的VSMC细胞周期的变化。可以看出,LV-PC1-kd+Comp和Ctrl组的G2/M期细胞比例明显少于LV-PC1-kd+DMSO组（P<0.05）。（4）收缩型VSMC标志物的检测,采用Western blot技术检测Ctrl组、LV-PC1-kd+DMSO组和LV-PC1-kd+Comp组的VSMC细胞的收缩型标志蛋白平滑肌22α蛋白（smooth muscle22 alpha,SM22α）及平滑肌肌动蛋白α2（Alpha-Smooth Muscle Actin,ACTA2）。Western blot检测结果显示,LV-PC1-kd+DMSO组和LV-PC1-kd+Comp组的SM22、ACTA2的蛋白表达无明显差异（P>0.05）。结论:MEK/ERK途径参与了PC-1低表达引起的人VSMC细胞表型向合成型的转化的过程。第四部分:PC-1介导VSMC表型变化的关键功能位点的研究目的:研究PC-1引起VSMC表型改变的蛋白关键位点。方法:将购买的人VSMC细胞系进行培养,分成四组,一组不进行任何处理;一组利用慢病毒感染引起VSMC的PC-1胞内段高表达;另外两组均应用RNAi技术,转染干扰组的VSMC细胞,其中一组利用定点突变的方法将PC-1胞内区的S4166突变为丙氨酸。利用Western blot技术检测四个组的p-ERK,ERK,SM22,ACTA2,CNN1,cyclin D1和myc的表达情况。结果:Western blot检测结果显示,定点突变后,突变组与PC-1敲除组相比,p-ERK,ERK,SM22,ACTA2,CNN1,cyclin D1和myc的表达在在两组中相似（P>0.05）;突变组与对照组比较,表型蛋白SM22,ACTA2,CNN1的表达明显降低（P<0.05）,而通路蛋白p-ERK,cyclin D1和myc的表达明显升高（P<0.05）。结论:PC-1的胞内端在PC-1诱导VSMC细胞表型变化中起着重要的作用;S4166可能是一个PC-1胞内端的一个重要的功能位点;VSMC细胞中的PC-1的S4166的突变能激活ERK通路,引起细胞表型的改变。