所有四吡咯化合物如血红素、叶绿素和维生素B12等对大部分生物体有非常重要的作用,它们合成的第一个共有底物是5-氨基酮戊酸。共有反应的第一步是两分子的5-氨基酮戊酸缩合成一分子的胆色素原,由5-氨基酮戊酸脱水酶（5-aminolevulinate dehydratase,ALAD）,又名胆色素原合酶的酶所催化。已从数个物种中纯化了ALAD,它是一个金属蛋白,不同生物中的ALAD依赖不同的金属离子。在微生物和哺乳动物中,ALAD是同源八聚体,在植物中是六聚体。已从近百个物种中克隆了ALAD的基因,所有物种的ALAD的氨基酸序列比对显示有约35%的同源性。利用重组技术定点突变确定了数个物种ALAD起催化作用的必需氨基酸残基。数个物种的ALAD的晶体结构显示酶活中心高度保守。枯草杆菌的ALAD基因和大肠杆菌的基因高度保守,但枯草杆菌的ALAD酶活中心的保守氨基酸序列和大肠杆菌略有不同。迄今未有枯草杆菌ALAD性质的报道。ALAD催化合成的产物PBG,不仅可以用于后续的酶活分析,而且也是癌症药物的前体。本实验从枯草杆菌克隆ALAD基因,在大肠杆菌中表达并测定其酶学性质,研究内容及结果如下:1.重组枯草杆菌ALAD表达载体的构建以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR方法扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因（hemB）。测序结果和报道的枯草杆菌hemB序列一致。将Nde I和EcoR I双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28a中构建成表达载体。2.5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达与一步纯化构建的表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,0.5 mmol/L的IPTG下诱导5 h,重组蛋白获得高效表达。SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为164 U·mg-1,表明酶以活性形式表达,组氨酸标签不显著影响酶活。利用ALAD加在N端的组氨酸标签,通过Ni-NTA进行纯化,SDS-PAGE表明可纯化至均一。3.5-氨基酮戊酸脱水酶的酶学性质枯草杆菌ALAD的酶的亚基分子质量约为41 kDa,全酶分子量为330 kDa,表明酶由8个同亚基寡蛋白组成;最适pH为8.0;动力学参数Km为7.4 mmol,Vmax为0.54 mmol·h-1;在55℃温浴10 min,保留85%的酶活,表明热稳定性较好;添加金属离子如K+、Zn2+、Mg2+、Li+、Fe3+和Mn2+都显著地增加了酶活力,最高达将近200%,Cu2+和Hg2+却显著地抑制了酶活。随β-巯基乙醇浓度的增加至10 mmol/L,酶活随之增加,β-巯基乙醇保护催化产物免于氧化。高浓度的还原剂二硫苏糖醇抑制酶活,推测它影响酶活中心半胱氨酸和金属离子的结合。数个氨基酸修饰剂的修饰结果表明,赖氨酸和半胱氨酸残基是酶催化必需的,而组氨酸和丝氨酸残基修饰仍然有一定酶活,主要是修饰剂改变了酶的空间结构。