研究背景癌症是严重危害公众健康的疾病之一,其发病率和死亡率一直在攀升,已成为疾病死因之首。一些高表达的细胞表面分子参与了癌症的发生,发展,并预示着不良临床结局。在这些细胞分子中,分化抗原簇44(Cluster of Differentiation44,CD44)是一种由外显子选择性剪切而形成的蛋白家族。CD44跨膜糖蛋白家族介导了各种细胞生物学过程,包括生长,生存,分化及运动的调控。CD44是透明质酸的天然受体,也可以与其他配体结合,如骨桥蛋白,胶原和基质金属蛋白酶等等。CD44与HER2,Src激酶和ERK等配体的结合,可以直接激发不同信号通路之间的交叉反应。卵巢癌的死亡率在女性恶性肿瘤中位居第五,而且是致死率最高的女性生殖肿瘤。但是在过去的几十年里,传统的卵巢癌治疗方案,即手术切除病灶联合化疗药物并没有明显改善卵巢癌患者的总体生存期。目前,我们对卵巢癌发生进展的具体机制还了解甚少。CD44的表达上调加强了肿瘤干细胞的分化,肿瘤细胞的增殖,耐药产生和转移。但是,CD44的表达在卵巢癌中的临床意义仍然存有争议。目前,还鲜有CD44的表达水平与卵巢癌患者的长期随访相关的研究。也尚未发现已报道的CD44与卵巢癌的相关研究中,将患者原发病灶,转移病灶及复发病灶联合分析。骨肉瘤是一种主要累及骨骼的肉瘤。尽管近年来手术治疗联合多种药物化疗方案治疗骨肉瘤取得了一定进展,但迄今为止,介导骨肉瘤恶性进展事件的细胞分子机制尚不清楚,包括转移病灶的形成,耐药现象的产生等等。已发表的CD44与骨肉瘤相关研究结果显示CD44敲除小鼠骨肉瘤动物模型中骨肉瘤转移受到抑制。但是,基于大量的骨肉瘤临床组织标本和完善的临床信息,关于CD44临床关联性的研究,还尚未见报道。微小RNA(micro RNA,mi R)可以结合靶基因m RNA的3’-非翻译区,参与调控肿瘤细胞的众多生物学功能。是否有特异性的micro RNA通过调控CD44而参与骨肉瘤的发生进展有待进一步研究。探究恶性肿瘤的发生发展机制是我们在攻克肿瘤道路上非常重要的环节,而研发新型肿瘤治疗策略也不容忽视。因此,研发新型肿瘤多药耐药逆转策略,已经成为肿瘤治疗过程中的关键。肿瘤多药耐药的发生涉及复杂的分子机制,其中最为经典的机制是P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的高表达,Pgp属于ATP依赖的跨膜蛋白转运体家族的成员,是多药耐药基因1(Multidrug resistance 1,MDR1)的蛋白产物。Pgp可将一些化疗药物通过主动转运作用外排细胞,细胞内有效的药物浓度不足,导致肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗。因此,Pgp是逆转肿瘤多药耐药最有潜力的靶点之一。随着1998年基因沉默的发现,小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)为提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性提供了新途径。基因传递过程中,有效的追踪和定位,对于我们了解被携带基因在胞浆内的命运非常重要。纳米技术的快速发展为基因传递和追踪提供了广阔的平台。目前,大多数纳米给药系统的追踪定位采用紫外线或短波长可见光作为激发光源,但是由于激发光的光毒性和较差的组织穿透性,限制了这些纳米系统的临床应用。然而,上转换纳米材料(Upconversion nanoparticle,UCNP)可使用近红外光作为激发光源,并将其转换为肉眼可见的发射光。因此,上转换纳米应用于基因传递和追踪将具有众多优势,包括无光损伤,无自荧光,无荧光淬灭和较深的组织穿透深度。尽管一些研究已经表明上转换纳米可以用于基因的传递和追踪,但是,尚未发现应用上转换纳米治疗肿瘤耐药同时追踪定位携带基因的相关研究报道。第一部分CD44在卵巢癌转移,复发及产生耐药中的作用研究目的本课题的研究目的是评估CD44表达在卵巢癌中的临床意义,然后进一步研究CD44在卵巢癌进展中的生物学功能。方法1.免疫组织化学染色法检测人类卵巢癌组织芯片中CD44的表达水平。纳入本研究的研究对象是在美国哈佛医学院麻省总医院接受治疗的26例卵巢癌患者,其中每例患者均有原发期,转移期和复发期的肿瘤组织标本。2.建立人卵巢癌细胞的裸小鼠移植瘤模型,蛋白印迹法(Western blot)检测肿瘤复发的过程中,肿瘤组织CD44蛋白表达水平的变化。3.Western blot和细胞免疫荧光法检测细胞的CD44蛋白表达水平。4.MTT法和3D细胞培养法分别检测细胞的增殖能力和细胞球体形成能力。5.MTT法检测细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。6.采用划痕修复实验和基质胶侵袭实验,分别检测细胞的迁移和侵袭潜能。7.采用Graph Pad Prism 5软件进行数据的统计分析,所有数据表示为均数±标准差。两组数据间的比较方法为双侧Student’s t-test或Mann-Whitney’s检验。无病生存期分析和总生存期分析方法为Kaplan-Meier survival curves和Gehan-Breslow-Wilcoxon test。以α=0.05作为检验水准。结果1.原发卵巢癌组织与转移/复发卵巢癌组织中CD44蛋白表达水平比较及高表达CD44与卵巢癌患者生存期的相关性。(1)免疫组织化学染色人类卵巢癌组织芯片的结果表明,原发,转移和复发卵巢癌组织CD44表达相对评分分别为1.43,2.06和2.04。其中转移组与原发组比较P<0.05,复发组与原发组比较P<0.05。(2)生存分析结果显示,高蛋白表达水平的CD44与卵巢癌患者总生存率关联性P<0.05,CD44与无病生存率关联性P<0.05。2.CD44在卵巢癌细胞系中的表达情况。SKOV-3/SKOV-3TR和OVCAR8/OVCAR8TR均表达一定蛋白水平的CD44,然而,耐药细胞SKOV-3TR和OVCAR8TR均比其对应的敏感细胞SKOV-3和OVCAR8表达较高蛋白水平的CD44(P<0.05)。3.人卵巢癌细胞的裸小鼠移植瘤模型中复发卵巢癌的CD44蛋白表达水平检测。生理盐水组与10 mg/kg紫杉醇组肿瘤组织中CD44蛋白表达水平比较没有统计学差异(P>0.05)。然而,20 mg/kg和25 mg/kg紫杉醇治疗组肿瘤组织中CD44表达水平与生理盐水组比较均有显著升高(P<0.05)。4.CD44 sh RNA基因沉默OVCAR8细胞中CD44后,细胞的增殖能力和球体的形成能力变化。(1)成功建立OVCAR8Lentivirus only(空慢病毒载体转导)),OVCAR8Non-specific sh RNA(携带非特异性sh RNA慢病毒载体转导)和OVCAR8CD44 sh RNA(携带CD44sh RNA慢病毒载体转导)三种细胞系,OVCAR8CD44 sh RNA细胞中CD44蛋白表达被稳定抑制。(2)与空白对照组OVCAR8比较,OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific sh RNA的增殖状况均无明显差异(P>0.05),而OVCAR8CD44 sh RNA细胞的生长被显著抑制(P<0.05)。(3)OVCAR8CD44 sh RNA细胞形成的细胞球体直径比其他三种组细胞OVCAR8,OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific sh RNA要小(P<0.05)。5.CD44 sh RNA基因沉默OVCAR8细胞中CD44后,细胞对化疗药物敏感性的影响。OVCAR8CD44 sh RNA细胞几乎不能够耐受0.006μM的紫杉醇,而在同样给药浓度下,OVCAR8,OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific sh RNA细胞仍能够较好地生长。6.CD44对卵巢癌细胞迁移和侵袭功能的影响。(1)经过24 h迁移后,空白对照组和非特异性si RNA转染组中的细胞划痕几乎被修复。而CD44 esi RNA转染组的细胞划痕修复能力明显受到抑制(P<0.05)。(2)CD44 esi RNA转染组的细胞穿过基质胶的数目明显少于空白对照组和非特异性si RNA转染组(P<0.05)。结论:CD44表达水平上调是卵巢癌转移,复发及对目前化疗方案产生耐药等一系列事件发展过程中的重要环节。第二部分mi R-199a-3p直接调控CD44参与骨肉瘤恶性进展的研究目的本课题的研究目的是探究CD44在骨肉瘤中的作用,同时,研究micro RNA调节CD44在骨肉瘤进展中的作用。方法1.免疫组织化学染色法检测人类骨肉瘤组织芯片中CD44的表达水平。纳入本研究的研究对象是,1992-2010年在美国哈佛医学院麻省总医院接受诊断治疗的骨肉瘤病人的114例组织标本。这些组织标本分布于原发,转移和复发三种不同时期。2.micro RNA芯片分析骨肉瘤细胞与成骨细胞的micro RNA表达水平差异,micro RNA数据库计算分析预测与人类CD44 m RNA 3’-非翻译区结合的micro RNA。3.Western blot评估细胞中CD44蛋白表达水平。4.MTT法检测骨肉瘤细胞对化疗药物多柔比星的敏感性。5.统计方法见第一部分。结果1.CD44在成骨细胞,骨肉瘤细胞系及骨肉瘤组织中的蛋白表达情况。成骨细胞NHOst有较弱的CD44蛋白表达,HOB-c中有一定的CD44表达。与成骨细胞比较,骨肉瘤细胞KHOS和U-2OS表达相对较高水平的CD44(P<0.05)。CD44同样表达于骨肉瘤组织中。2.原发骨肉瘤组织与转移/复发骨肉瘤组织中CD44蛋白表达水平比较及CD44与骨肉瘤总生存期和化疗反应的临床相关性。(1)转移组肿瘤组织标本比原发组表达较高蛋白水平的CD44(P<0.05),复发组比原发组表达较高蛋白水平的CD44(P<0.05)。(2)生存分析结果显示,高表达水平的CD44与骨肉瘤患者总生存率具有关联性(P<0.05)。(3)对化疗反应较差的骨肉瘤组织与对化疗药物敏感的组织比较,表达较高水平的CD44(P<0.05)。3.骨肉瘤中CD44与mi R-199a-3p的关联。(1)micro RNA.org和Target Scan数据库分析预测结果显示mi R-199a-3p的综合评分名列前茅,与CD44 m RNA可能的配对序列为3’-非翻译区的74到91位的核苷酸。(2)micro RNA芯片分析结果显示,与成骨细胞相比,mi R-199a-3p在骨肉瘤细胞中表达水平显著降低(P<0.05)。(3)在骨肉瘤细胞中,mi R-199a-3p以剂量和时间依赖模式抑制CD44的蛋白表达水平。4.转染mi R-199a-3p后,骨肉瘤细胞对化疗药物敏感性的变化。与空白对照组和非特异性micro RNA转染组比较,转染mi R-199a-3p组细胞对多柔比星的敏感性显著提高(P<0.05)。结论:mi R-199a-3p对CD44的调节作用与骨肉瘤的转移,复发和耐药产生密切相关。第三部分近红外激发和FRET追踪上转换纳米/MDR1 si RNA逆转卵巢癌耐药的研究目的本课题的研究目的是采用近红外光激发和FRET追踪上转换纳米颗粒/MDR1 si RNA复合体,同时增强卵巢癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性。方法1.采用热分解方法合成Na YF4:Yb,Er上转换纳米(UCNP),在纳米表面一层一层组装修饰聚丙烯酸(polyacrylic acid,PAA),聚乙烯亚胺(poly(ethylenimine),PEI)和MDR1 si RNA。2.透射电镜拍摄纳米颗粒UCNP,UCNP/PAA和UCNP/PAA/PEI的照片。3.Nano-ZS90纳米分析仪检测纳米的电位,直径大小分布。4.荧光分光光度仪检测纳米的上转换光谱。5.琼脂糖凝胶电泳和Pico Green法检测UCNP/PAA/PEI携带核苷酸的能力和效率。6.通过近红外光激发,检测UCNP/PAA/PEI和荧光标记的MDR1 si RNA之间的荧光能量转移现象,追踪胞浆内UCNP/PAA/PEI与MDR1 si RNA的分离和释放。7.Western blot评估细胞中Pgp的蛋白表达水平。8.MTT法检测细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。9.统计方法同第一部分。结果1.上转换纳米(UCNP)/聚丙烯酸(PAA)/聚乙烯亚胺(PEI),即UCNP/PAA/PEI纳米颗粒的相关指标检测。(1)UCNP/PAA的表面电位为-30 m V,UCNP/PAA/PEI的表面电位为+41m V。两种纳米电位的变换,表明UCNP表面成功地被负电聚合物PAA和正电聚合物PEI层层修饰。(2)近红外激发光(980 nm)激发下,UCNP/PAA/PEI纳米的发射光谱峰在530 nm和650 nm。2.UCNP/PAA/PEI携带核苷酸的潜能(1)UCNP/PAA/PEI装载核苷酸的效率和能力分别为97.264%和0.341μg/μl。(2)荧光显微镜下观察,UCNP/PAA/PEI可有效地将MDR1 si RNA,micro RNA Let-7和绿色荧光蛋白质粒DNA携带至细胞内。3.双光子成像系统追踪检测OVCAR8TR细胞内MDR1 si RNA与UCNP/PAA/PEI载体的结合和解离过的过程。(1)短时间孵育UCNP/PAA/PEI/MDR1 si RNA复合体后,荧光能量转移现象的发生表明MDR1 si RNA已经被携带至细胞内,但是还没有与纳米载体系统分离。(2)长时间孵育携带MDR1 si RNA的纳米后,荧光能量转移现象消失,间接表明MDR1 si RNA与UCNP/PAA/PEI载体分离。4.UCNP/PAA/PEI/MDR1 si RNA复合体对卵巢癌耐药细胞化疗药物敏感性的改变。(1)与空白对照组,单独UCNP/PAA/PEI及游离MDR1 si RNA处理组的OVCAR8TR细胞比较,UCNP/PAA/PEI/MDR1 si RNA复合体转染细胞的Pgp蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。(2)UCNP/PAA/PEI及UCNP/PAA/PEI/MDR1 si RNA复合体在本研究使用浓度下对卵巢癌细胞无明显毒性。(3)空白对照组,单独UCNP/PAA/PEI处理组和UCNP/PAA/PEI/MDR1si RNA复合体处理组细胞的紫杉醇IC50分别为0.91μM,0.80μM和0.59μM。UCNP/PAA/PEI/MDR1 si RNA复合体处理组的细胞IC50比空白对照组降低1.5倍(P<0.05)。结论:UCNP/PAA/PEI作为有效的基因传递系统,可追踪并逆转卵巢癌紫杉醇耐药。