近年来,抗生素类药物被广泛用于医疗、畜禽和水产养殖业。由于其机体代谢率低,大部分抗生素以原药或代谢物的形式通过尿液和粪便排出体外进入环境,对水体、土壤等造成严重污染,进而会影响环境微生物及功能酶的活性。四环素类抗生素（TCs）作为其中应用最广泛、用量最大的抗生素之一,其毒性效应和调控策略已得到广泛关注。目前关于TCs毒性污染已被广泛探讨,但针对水体、土壤和污水处理中TCs抑制功能酶活性的问题缺乏系统研究:多数研究只是浅层面关注抗生素对单一功能酶活性抑制效应,且未涉及毒性抑制的具体分子机制。因此,理清抗生素对功能酶活性的抑制差异化效应及其分子机制不仅为系统评价抗生素的毒性效应和环境风险提供理论依据而且也为调控抗生素废水的工程应用提供了技术依据。本研究以TCs为基础研究物,通过分子毒性实验、荧光光谱实验和分子对接模拟技术评价其对过氧化氢酶、脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶的抑制效应及分子机制;进而利用化学氧化UV/H₂O₂技术调控TCs的潜在毒性,通过分子毒性实验和分子对接模拟对抗生素/氧化后副产物与过氧化氢酶结合物的抑制效应和结构特征进行解析,阐明分子机制差异。将理论模拟数据与毒性实验结果进行对照,全面探究TCs抑制功能酶活性的毒性作用机制,为控制TCs毒性的潜在风险提供了有效的理论支持。主要研究工作如下:（1）TCs对功能酶的毒性效应和机制研究。通过分子毒性实验发现TCs对过氧化氢酶的活性存在显著抑制,将抑制率对抗生素浓度进行线性拟合后得到抑制顺序是四环素>土霉素>金霉素>强力霉素;TCs对脲酶的活性存在显著促进,将促进率对抗生素浓度进行线性拟合后得到促进顺序是四环素>土霉素>强力霉素>金霉素;TCs对碱性磷酸酶的活性存在促进作用,将促进率对抗生素浓度进行线性拟合后得到促进顺序是土霉素>四环素>强力霉素>金霉素;TCs对蔗糖酶的活性影响比较弱。通过荧光光谱实验和分子模拟技术阐明TCs与功能酶相互作用的机制。荧光分析结果表明TCs与四种功能酶的相互作用过程中,酶的荧光强度都具有明显的下降趋势,即TCs与功能酶发生了淬灭作用。结合分子毒性实验数据可推断TCs对过氧化氢酶、脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶的荧光淬灭类型:TCs在过氧化氢酶的催化活性中心发生静态淬灭,同时荧光强度变化与毒性在344.4 nm下呈正相关关系;TCs与脲酶发生静态淬灭,荧光强度与毒性呈强正相关关系,据此推断该反应是由变构效应引起的,作用中心是非催化活性中心;TCs与于碱性磷酸酶发生静态淬灭,荧光强度与毒性呈弱正相关关系,据此推断该反应是由变构效应引起的,作用中心是非催化活性中心;TCs于蔗糖酶的非催化活性中心发生静态淬灭。结合分子模拟技术研究发现:1)TCs在过氧化氢酶的催化活性中心与其结合形成复合物,结合面积、能量变化和毒物毒性呈正相关,可作为评价抗生素对过氧化氢酶致毒机制的重要指标;在TCs和过氧化氢酶的相互作用中,O^1C→Glu₂₅₂,O¹←Arg₁₉₅,O⁶→Asp₂₄₉等氢键作用和N⁴-Glu₂₅₂离子键作用与毒物毒性正相关,即TCs抑制过氧化氢酶活性与以上氢键、离子键作用密切相关;但O¹⁰→Pro₃₆₃,O¹⁰→Lys₄₅₅,O¹²→Asn₁₂₇等氢键作用和N⁴-Asp₃₇₉离子键作用和毒物毒性负相关,即以上作用越强毒物对过氧化氢酶抑制作用越小;O¹←Arg₃₃₄,O⁶→Val₃₅₁,O¹⁰→Ser₃₁₆等氢键作用对毒物毒性变化相关性较小。2)TCs在脲酶的非催化活性中心与其结合形成复合物,结合面积与毒性相关性不大;能量变化与毒性负相关,可作为评价抗生素对脲酶致毒机制的重要指标;在TCs和脲酶的相互作用中,C⁴→Glu₂₅₇,N⁴→Asp₂₈₃,C⁴³→Glu₂₅₇等氢键作用和N⁴-Glu₂₅₇,N⁴-Asp₂₈₃,N⁴-Asp₂₂₁,N⁴-Glu₃₆₉离子键作用与毒物毒性正相关,即TCs抑制脲酶活性与以上氢键、离子键作用密切相关;但O⁶→Glu₁₄₅,N⁴→Asp₁₁,C^4’→Glu₁₄₅等氢键作用和N⁴-Asp₁₁等离子键作用和毒物毒性负相关,即以上作用越强毒物对脲酶抑制作用越小;N²¹→Glu₂₂₀,N²¹→Asp₂₈₃,O¹¹←Ile₅₃₄等氢键作用和N⁴-Phe₅₆₇离子键作用对毒物毒性变化相关性较小。3)TCs在碱性磷酸酶的非催化活性中心与其结合形成复合物,结合面积、能量变化和毒物毒性呈正相关性,可作为评价抗生素对碱性磷酸酶致毒机制的重要指标;在TCs和碱性磷酸酶的相互作用中,C⁴²→Asp₃₈₀,C⁴¹→Asp₃₈₀,O¹³→Glu₄₁₁等氢键作用和N⁴-Asp₃₈₀,N⁴-Glu₄₀₇,N⁴-Glu₄₁₁离子键作用与毒物毒性正相关,即TCs抑制碱性磷酸酶活性与以上氢键、离子键作用密切相关;但N²¹→Asp₁₅₃,O²¹←Ser₁₀₂,O²¹←Arg₁₆₆等氢键作用和C⁶-His₃₃₁离子键作用和毒物毒性负相关,即以上作用越强毒物对碱性磷酸酶抑制作用越小;O⁶→Asp₁₀₁,N²¹→Val₉₉,N²¹→Asp₃₂₇,O⁶→Glu₁₅₀氢键作用对毒物毒性变化相关性较小。4)TCs在蔗糖酶的非催化活性中心与其结合形成复合物,四环素与蔗糖酶相互作用参与的氢键包括N⁴→Glu₂₀₃,C⁴¹→Glu₂₀₃,N²¹→Leu₂₀₇等,离子键包括N⁴-Glu₂₀₃,N⁴-Glu₂₀₉;金霉素与蔗糖酶相互作用参与的氢键包括N⁴→Glu₂₀₃,C^4’→Asp₂₂,C^4A→Glu₂₀₃等,离子键包括N⁴-Glu₂₀₃;土霉素与蔗糖酶相互作用参与的氢键包括O¹¹←Asn₁₁₄,N²¹→Glu₂₀₃,N²¹→Asn₂₂₈等,离子键包括N⁴-Glu₂₀₃,N⁴-Asp₂₂,N⁴-Glu₂₅₁;强力霉素与蔗糖酶相互作用参与的氢键包括N⁴→Glu₂₀₃,O¹¹←Asn₁₁₄,N²¹→Glu₂₀₃等,离子键包括N⁴-Glu₂₀₃,因此上述氢键和离子键是评价TCs和蔗糖酶相互作用机制的关键指标。（2）UV/H₂O₂调控TCs抑制过氧化氢酶活性的效应和机制研究。通过将TCs进行UV/H₂O₂氧化预处理得到降解速率大小顺序为k_四环素>k_土霉素>k_金霉素,而后对过氧化氢酶进行酶活性抑制实验。通过比较氧化前后样品的抑制率发现,氧化处理抗生素样品对过氧化氢酶的活性抑制大于对应浓度标准品的抑制性,表明氧化后的抗生素样品中包含的副产物对过氧化氢酶也有一定的毒性。随后通过质谱分离鉴定获取典型副产物结构并与过氧化氢酶进行分子对接模拟实验。研究发现TC-DBPs总氢键作用能量变化值大小顺序为C₂₀H₁₈NO₁₀>C₂₀H₁₈NO₉>C₂₀H₁₈NO₈;CTC-DBPs总氢键作用能量变化值大小顺序为C₂₀H₁₇ClNO₈>C₂₁H₁₉ClNO₉>C₂₁H₁₉ClNO₇;OTC-DBPs总氢键作用能量变化值大小顺序为C₂₂H₂₅N₂O₁₁>C₂₂H₂₃N₂O₁₀>C₂₁H₂₃N₂O₈>C₂₁H₂₅N₂O₈>C₂₂H₂₅N₂O₁₀>C₂₂H₂₃N₂O₉。通过与三种TCs和过氧化氢酶相互作用氢键分别相比较,四环素副产物C₂₀H₁₈NO₉保留有与原毒素相同的氢键作用O¹¹←Asn₁₂₇,O¹←Lys₂₅₆等;C₂₀H₁₈NO₁₀保留有与原毒素相同的氢键作用O¹¹←Asn₁₂₇,N²¹→His₃₆₈等;C₂₀H₁₈NO₈保留有与原毒素相同的氢键作用O¹¹←Asn₁₂₇,N²¹→His₃₆₈等。金霉素副产物C₂₁H₁₉ClNO₉没有相同氢键;C₂₀H₁₇ClNO₈保留有与原毒素相同的氢键作用N^2’→Asn₃₂₃,O¹²→SO4₅₀₅;C₂₁H₁₉ClNO₇保留有与原毒素相同的氢键作用O¹²→SO4₅₀₅。土霉素副产物C₂₂H₂₅N₂O₁₀保留有与原毒素相同的氢键作用N⁴→Glu₁₂₅,C⁵→Asp₃₇₉,O⁶←His₃₆₈;C₂₂H₂₅N₂O₁₁保留有与原毒素相同的氢键作用C⁵→Asp₃₇₉,O⁶←His₃₆₈;C₂₂H₂₃N₂O₁₀保留有与原毒素相同的氢键作用O⁶→Asn₃₆₉;C₂₁H₂₅N₂O₈保留有与原毒素相同的氢键作用O¹³→His₃₅₄,O⁶→Asn₃₆₉;C₂₁H₂₃N₂O₈保留有与原毒素相同的氢键作用O¹³→His₃₅₄,O⁶→Asn₃₆₉;C₂₂H₂₃N₂O₉保留有与原毒素相同的氢键作用O¹³→His₃₅₄。不难发现,上述相同氢键作用可以作为评价TCs及其副产物对过氧化氢酶活性抑制作用的重要指标。综上所述,本研究发现TCs对过氧化氢酶、脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶活性的毒性效应和机制都存在显著差异;针对TCs对过氧化氢酶显著的抑制作用,可以通过高级氧化中的UV/H₂O₂联合氧化法进行调控,但是调控后的抑制效应和机制评价表明副产物的毒性不容忽视;通过分子模拟发现与毒性作用密切相关的部分关键位点和氢键作用可以作为全面调控TCs抑制过氧化氢酶活性机制的重要指标。