研究背景整形外科领域中,头面部软骨缺损是一种普遍且治疗困难的疾病。常见的头面部软骨缺损包括先天性鼻畸形、小耳畸形以及由创伤形成的耳软骨、鼻软骨缺损等。由于软骨组织缺乏神经、血管及淋巴组织,再生能力有限,使得软骨一旦受损便很难修复。目前,治疗软骨缺损的方法主要包括自体软骨移植术、异体软骨移植术以及人工假体填充术。但是,这些临床治疗手段也存在诸多缺点,例如患者损伤大、术后并发症多、软骨取材有限、自体移植后吸收及人工材料移植后免疫排斥等。因此,众多学者一直致力于寻求新的治疗方案。近年来,软骨组织工程的蓬勃发展为解决这一问题提供了新的思路和方法。软骨组织工程是将种子细胞种植在生物相容性好的材料上,并与之形成复合物,然后将复合物植入软骨缺损处,从而修复受损软骨的一门新兴学科。组织工程软骨的构建需要三个关键要素:（1）合适的支架,（2）足够数量的具有正常功能的种子细胞,（3）促进细胞增殖和维持细胞表型特征的细胞因子。支架作为三要素之一,在软骨能否成功构建方面起着至关重要的作用。理想的软骨组织工程支架应具有以下特点:（1）足够的机械强度,（2）合适的生物降解性,（3）优良的生物相容性。支架不仅应支持细胞存活,更应促进软骨形成。单一的生物学材料很难满足上述全部特点。因此,复合支架应运而生,并广泛应用于软骨组织工程。由于头面部的软骨缺损面积较小,形状不规则,对支架的要求则更为复杂。体积较大的支架不仅耗费大量软骨细胞而且形状很难满足植入需要。因此,构建头面部软骨支架即要满足组织工程支架的全部需求也要具备体积小,形状可调整的优点。本实验中,我们选择构建微支架。微支架直径较小,一般在几毫米左右,不仅可以通过排列多个微支架调整形状,而且对种子细胞数量的需求远低于一般支架,适合应用于构建头面部软骨支架。Ⅰ型胶原蛋白（TypeⅠcollagen,COLI）占全部胶原蛋白的80%-90%,几乎在所有结缔组织中都有表达。Ⅰ型胶原因其来源广泛、提取简便、生物相容性良好,是软骨组织工程中最有前途的生物材料之一。然而,Ⅰ型胶原有着较弱的机械性能,限制了其单独使用。因此需要与其他生物材料复合应用增强支架的机械强度。骨粉（True-bone-ceramic,TBC）是通过新鲜牛松质骨在高温下两次煅烧而获得的一种基于磷酸钙的生物材料。骨粉具有与人类骨组织相近的多孔结构,良好的机械强度以及无细胞毒性,可作为支架的骨架结构。而大颗粒骨粉,直径一般在1-2mm,作为支架主体,具有以下优点:（1）种子细胞需求少,（2）相连多孔结构有利于细胞生长。然而,由于其缺少细胞黏附性,很少单独使用,往往会添加其他材料来弥补这一弱点。本实验中,我们构建了Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉（COLI/TBC）微支架,利用大颗粒骨粉作为支架主体保证机械强度的同时通过Ⅰ型胶原涂层增加生物相容性。为了探索合适的Ⅰ型胶原浓度,我们设置了3个Ⅰ型胶原浓度梯度（1mg/ml、5mg/ml、12mg/ml）,并通过详细评估微支架的理化性能、体外成软骨研究、以及体内植入后实验全方位评估该支架构建组织工程软骨及临床应用的可能性。研究目的1.评估不同Ⅰ型胶原浓度涂层大颗粒骨粉微支架理化性能。2.明确不同Ⅰ型胶原浓度涂层大颗粒骨粉微支架体外成软骨能力。3.明确不同Ⅰ型胶原浓度涂层大颗粒骨粉微支架在裸鼠体内成软骨能力。研究方法第1部分Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微合支架表征1.利用光镜、电镜观察微支架结构,观察Ⅰ型胶原涂层情况。2.检测微支架溶胀性能、降解性能、化学结构,分析不同微支架间理化性能差异。3.分离培养软骨细胞,采用CCK8检测法评估微支架材料的细胞毒性,评估各组微支架应用于软骨细胞实验的可能性。第2部分Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架体外成软骨研究1.利用活/死细胞染色试剂盒检测不同培养时间细胞在微支架上的生长分布情况。2.利用电镜观察特定培养时间细胞在微支架上的生长及细胞外基质分泌情况。3.利用HE染色、番红O染色检测体外培养细胞成软骨能力。4.利用免疫组织化学染色检测体外成软骨相关蛋白表达情况。第3部分Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架体内成软骨研究1.裸鼠内植入体外培养的支架-细胞复合物。2.大体观察特定时间点植入物变化。3.HE、番红O染色、免疫组织化学染色体内成软骨情况。研究结果第1部分Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架表征1.光镜与电镜下均显示Ⅰ型胶原在大颗粒骨粉上的均匀附着,随着胶原浓度的增加,大颗粒骨粉表面的胶原纤维排列更紧密。2.随着胶原浓度增加,Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架的溶胀率随之升高,但是降解率无明显差异。FTIR分析可见Ⅰ型胶原特征官能团和骨粉特征官能团。3.通过微支架浸提液培养的软骨细胞活力与对照组无明显差异,可见微支架无细胞毒性,可用于细胞实验。第2部分Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架体外成软骨研究1.随着体外培养时间的增加,各组的细胞数量均有不同程度的增加。并且随着胶原浓度的提高,细胞数量明显升高。2.体外培养4周软骨细胞分泌大量细胞外基质,且胶原浓度的提高显著促进了细胞外基质的分泌和成软骨相关蛋白的表达。第3部分Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架体内成软骨研究裸鼠体内植入4周时三组微支架-细胞复合物形态完好,组织学显示二型胶原强阳性表达。胶原浓度的提高使得细胞增殖水平,成软骨情况及蛋白表达情况都得到显著提升。研究结论1.Ⅰ型胶原涂层大颗粒骨粉微支架具有良好的理化性能及生物相容性可以作为构建组织工程软骨的支架材料。2.Ⅰ型胶原涂层增加了微支架的细胞黏附性。3.胶原浓度越高,复合支架体内外成软骨性能越优良,12mg/ml胶原浓度更适宜作为组织工程软骨支架。