论文部分内容阅读
目的：构建miR-144真核表达载体，检测miR-144是否调控小鼠RAW264.7巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达。方法：结合文献，通过预测软件分析，选取评分较高、可作用于ABCA1mRNA3’非编码区（ABCA1mRNA3’UTR）的miR-144。通过分子克隆技术，利用PCR扩增miR-144和ABCA1mRNA3’UTR的DNA序列，酶切胶回收后，分别连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）载体和pcDNA3.1（+）-luciferase载体上。测序后，运用双荧光素酶报告基因系统检测萤火虫荧光素酶的活性，观察microRNA-144是否对ABCA1mRNA3’UTR具有直接靶向作用。运用LipofectamineTM2000将pcDNA3.1（+）空载体、pcDNA3.1（+）-miR-144转染至小鼠RAW264.7巨噬细胞。通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染后miR-144的表达含量。通过qRT-PCR和Western blot法检测过表达miR-144后ABCA1在mRNA和蛋白水平的变化。结果：miR-144PCR产物连接至pcDNA3.1（+）载体上，ABCA1mRNA3’UTR连接至pcDNA3.1（+）-luciferase载体上，测序正确。运用双荧光素酶报告基因系统检测发现，和对照组（联合转染pcDNA3.1（+）空载、pcDNA3.1（+）-luciferase-ABCA13’ UTR和PRL-SV40）相比，实验组（联合转染pcDNA3.1（+）-miR144、pcDNA3.1（+）-luciferase-ABCA13’ UTR和PRL-SV40可以显著降低萤火虫荧光素酶的活性（P＜0.05），证明microRNA-144对ABCA1mRNA3’UTR具有直接靶向作用。将pcDNA3.1（+）空载、pcDNA3.1（+）-miR-144转染至小鼠RAW264.7细胞中，qRT-PCR结果显示，转染pcDNA3.1（+）空载组microRNA-144表达无明显变化（P＞0.05）；转染pcDNA3.1（+）-miR-144组中miR-144表达量显著增高（P＜0.01）.qRT-PCR结果显示，转染pcDNA3.1（+）空载和pcDNA3.1（+）-microRNA-144对ABCA1mRNA表达水平无明显影响（P＞0.05），Western blot结果显示，与pcDNA3.1（+）空载组相比，转染pcDNA3.1（+）-microRNA-144可以显著降低ABCA1蛋白水平的表达（P＜0.01）。结论：miR-144可以在转录后水平抑制ABCA1蛋白的表达。