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猪链球菌（Streptcococcus suis，SS）、胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP）和副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis，HPS）分别是引起猪链球菌病（Swine strepococosis），猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae，PCP）和格拉瑟氏病（Gl?sser’s disease）的主要病原，也是养猪业常见的三种细菌性病原菌。这三种病原菌均有多个血清型，主要侵害幼龄仔猪和保育猪，引起一系列呼吸道症状，导致较高的发病率和死亡率，且在临床上鉴别难度较大，给全球生猪养殖造成了巨大的经济损失。 本研究基于猪链球菌谷氨酸脱氢酶（gdh）基因，胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素（Apx IV）基因，副猪嗜血杆菌16S r RNA基因序列建立了猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌三重PCR方法；基于猪链球菌cps1J、cps2J、cps7H、cps9H基因序列建立猪链球菌血清1、2、7、9型多重PCR方法；基于猪胸膜肺炎放线杆菌血清cps1B、cps9D、cps5B、cps2D型和Apx IV毒素基因序列建立猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1、3、5、7型及ApxIV多重PCR方法；基于猪胸膜肺炎放线杆菌Hypb、cps6D、cps8A、cps1A基因序列建立猪传染性胸膜肺炎血清2、6、8、12型多重PCR方法，研究结果表明，本研究建立的四套多重PCR的重复性，特异性和敏感性较好，通过本方法对一些临床样品进行了检测，其结果与单一PCR检测结果一致。 SS、APP和HPS三重PCR方法的建立：本研究针对猪链球菌谷氨酸脱氢酶（gdh）基因，猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素（Apx IV）基因，副猪嗜血杆菌16S r RNA基因序列各设计1对特异性引物，分别能扩增出gdh688bp、Apx IV417bp和16S rRNA822bp的DNA片段，将三对引物置于25μL体系进行优化，找出最优反应体系，并经酶切鉴定，确定目的片段得到了正确扩增。重复性特异性实验表明：该实验具有很好的重复性，对多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪放线杆菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌等具有特异性。敏感性实验表明：最低可检测到的细菌含量为：SS104CFU/mL；APP103CFU/mL；HPS103CFU/mL。人工模拟实验对SS、APP、HPS的敏感性均为104CFU/mL。对采集的30份疑似病例细菌分离细菌分离鉴定后，用本研究建立的三重PCR及细菌分离方法进行检查，结果表明，该三重PCR方法灵敏度与常规细菌分离方法符合率达到93％。证明本实验建立的SS、APP和HPS的三重PCR方法在检测上述三种疾病方面具有应用价值。 SS血清1、2、7、9型多重PCR方法的建立：针对SS血清1、2、7、9型的荚膜多糖合成相关基因（CPS）序列各设计1对特异性引物，分别能扩增出550bp、675bp、150bp和300bp的DNA片段，将四对引物置于25μL体系进行优化，找出最优反应体系，并经酶切鉴定，确定目的片段得到了正确扩增。重复性，特异性实验表明：该实验具有良好的重复性，对猪丹毒杆菌、猪大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、葡萄球菌、猪放线杆菌、猪沙门氏菌DNA模板PCR扩增，均无特异性条带。对猪链球菌野毒株提取DNA模板，分别使用本多重PCR方法和细菌分离方法检测，将检测结果做比较，结果显示符合率达100%。本四重PCR方法快速有效，可在3小时左右得到检测结果。 APP血清1、3、5、7型及Apx IV多重PCR方法的建立：针对APP血清1、3、5、7型的cps基因及APP种属Apx IV基因序列各设计1对特异性引物，分别能扩增出959bp、520bp、825bp、600bp和417bp的DNA片段，将五对引物置于25μL体系进行优化，找出最优反应体系，并经酶切鉴定，确定目的片段得到了正确扩增。重复性，特异性实验表明：该实验具有良好的重复性，建立的五重PCR方法能对同一样品中的APP血清1、3、5、7型及APP的DNA模板进行扩增，均无交叉反应。对猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌DNA模板PCR扩增，均无特异性条带。对APP血清1-15型DNA模板PCR扩增，所有血清型均可扩增出Apx IV的特异性条带，且除APP血清1、3、5、7型可以扩增出相应的特异性条带，其他血清均只能扩增出Apx IV的特异性条带。对APP血清1、3、5、7型及Apx IV的检测敏感性皆为103CFU/mL。本五重PCR方法快速有效，可在3小时左右得到检测结果。 APP血清2、6、8、12型多重PCR方法的建立：针对APP血清2、6、8、12型的荚膜多糖合成相关基因(CPS)序列各合成1对特异性引物，分别能扩增出247bp、718bp、1106bp和347bp的DNA片段，将四对引物置于25μL的体系通过单一PCR和四重PCR体系条件的优化，找出最优反应体系，并经酶切鉴定，确定目的片段得到了正确扩增。重复性，特异性实验表明：该实验具有良好的重复性，建立的四重PCR方法能对同一样品中的APP血清2、6、8、12型的DNA模板进行扩增，均无交叉反应。猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、DNA模板PCR扩增，均无特异性条带。对APP血清1-15型基因组DNA模板PCR扩增，除APP血清2、6、8、12型可以扩增出相应的特异性条带外均不能扩增出任何特异性条带。对APP血清2、6、8、12型的检测敏感性皆为103CFU/mL。人工模拟实验对SS、APP、HPS的敏感性均为104CFU/mL。本四重PCR方法快速有效，可在3小时左右得到检测结果。