表面增强拉曼散射技术(SERS)因其灵敏度高,抗干扰性强等优势受到研究者的关注,并被广泛应用于药物分析,生物检测等领域。另外,多元检测技术使得同时检测多种生物分子成为可能,从而节省了大量的分析时间,成本以及样品用量。光子晶体微球是一种三维有序结构的材料,常常被作为多元检测的编码载体。因此,发展光子晶体编码微球为载体的高灵敏度多组分SERS生物分析,将是一个非常有意义的研究方向。在本文中,我们以二氧化硅光子晶体为固相免疫基底,利用其反射峰的不同进行编码,与SERS信号相结合,并设计了三种拉曼信号放大的方式,提高灵敏度,实现多元检测分析。具体研究内容如下:(1)将两种不同反射峰编码的Ag/SiO2拉曼光子晶体微球(反射波长分别为500 nm和600 nm)分别修饰上CEA和AFP抗体并作为固相免疫基底;然后利用合成的具有高密度“热点”的多孔金银合金(p-AuAg)纳米粒子,制备出抗体/4-MBA/p-AuAg纳米粒子并作为SERS免疫探针;最后将两者加入到CEA和AFP双组份待测抗原中,37℃温浴条件下反应30 min,形成“固相免疫基底-相应抗原-SERS免疫探针”夹心复合结构。通过检测两种光子晶体编码微球的反射峰位置和显微镜照片来确定待测抗原的种类,并通过检测探针分子的SERS信号最终确定待测抗原浓度。两种肿瘤标志物CEA和AFP的检出限分别为1×10-8和1×10-5 ng/mL。我们提出的新型多元检测方法,编码稳定,交叉干扰小,灵敏度高。(2)将两种不同反射峰编码的SiO2光子晶体微球(反射波长分别为500 nm和600 nm)分别修饰上CEA和AFP抗体并作为固相免疫基底;然后加入相应的CEA和AFP双组份待测抗原;再加入分别修饰了 CEA和AFP抗体的Au纳米粒子,37℃温浴条件下反应30 min,形成三明治免疫结构。其中Au纳米粒子具有双重的SERS信号增强功能:(1)作为SERS基底能增强拉曼报告分子(TMB)的SERS信号;(2)Au纳米粒子具有过氧化氢模拟酶性能,在H2O2存在的情况下会将非活性的拉曼报告分子转化成活性的拉曼报告分子,从而增强信号。所以在形成三明治免疫结构后再加入H2O2,和非活性的拉曼报告分子(TMB),37℃温浴条件下活化20 min,将非活性的TMB氧化成活性的TMB,立即检测拉曼信号并确定抗原的浓度。最后通过检测微球的反射峰光谱和显微镜照片来确定待测抗原的种类,两种肿瘤标志物CEA和AFP的检出限分别为10-3 ng/mL和10-2ng/mL。该新型多元检测方法,交叉干扰小,操作简便且成本较低。(3)将两种不同反射峰编码的SiO2光子晶体微球(反射波长分别为500 nm和600 nm)分别修饰上CEA和AFP抗体并作为固相免疫基底;然后加入相应的CEA和AFP双组份待测抗原;再加入辣根过氧化物酶标记的CEA和AFP抗体(HPR-CEA,HPR-AFP),37℃温浴条件下反应45 min,制备了三明治免疫结构。在H2O2存在下,辣根过氧化物酶(HPR)可以将酪胺转化成一种中间体,且该中间体会与蛋白质表面的芳香氨基酸形成共价化合物,从而结合在三明治免疫结构的表面。所以我们将修饰了探针分子(4-MBA)的Au@Ag纳米立方体去对酪胺进行SERS标记,加入H2O2.使Au@Ag@4-MBA通过酪胺在三明治免疫结构上沉积和聚集,从而放大4-MBA的SERS信号。通过检测微球的反射峰光谱和显微镜照片来确定待测抗原的种类,并检测其拉曼信号来确定抗原的浓度。两种肿瘤标志物CEA和AFP的检出限均为10-5 ng/mL,利用该酪胺信号放大的方法检测得到的SERS信号交叉干扰小,灵敏度较高,强度约为传统SERS免疫分析的4倍。