研究背景及目的:在炎症反应的早期,多形核中性粒细胞（PMN）最先被招募到组织炎症区域,其激活、趋化、游走引起血管内皮屏障损伤,此过程中由于白细胞被激活所释放出的细胞因子发挥了重要的作用。肝素结合蛋白（HBP）作为PMN分泌的重要颗粒蛋白,参与疾病的病理生理过程,可以影响内皮细胞（EC）增加血管通透性,导致血管泄漏,继而引发组织水肿甚至低血压以及器官功能不全。近年来越来越多的学者通过临床试验以及基础实验发现,血液中HBP水平与脓毒症患者感染性休克的严重程度相关,可能成为预测脓毒症发生以及病情恶化的生物标志物之一。肝素结合蛋白（HBP）也被称作天青杀素（AZU-1）以及阳离子抗菌蛋白37或 CAP37（cationic antimicrobial protein of 37 000）。HBP功能多样,既可以诱导血管渗漏、水肿形成并对白细胞具有趋化作用。研究发现脓毒症患者在发展为低血压或器官功能障碍前数小时内血浆HBP水平升高,可作为72h内疾病进展至严重脓毒症的一个强大预测因子。HBP对血管通透性的改变主要是通过影响内皮屏障实现的,血管EC是HBP释放后的靶细胞,HBP通过直接或者间接的方式破坏内皮屏障成分,如细胞间连接和细胞外糖萼,影响内皮细胞内信号转导,致使内皮细胞细胞骨架重构并最终导致内皮屏障功能障碍,血管屏障功能损伤和细胞炎性反应促使蛋白质等大分子物质过度地渗漏到循环之外,导致循环障碍和器官功能不全。由于内皮细胞表面的糖萼结构中存在众多类肝素样物质,故目前普遍认为多糖包被是HBP在内皮细胞表面的结合位点,然而内皮细胞表面是否还存在更直接的表面受体仍有待研究。转化生长因子-β（Transforming growth factor-3,TGF-β）是一个进化上保守的多肽因子分泌家族,调节胚胎发生和成体组织稳态等多个方面。TGF-β家族成员也参与许多疾病的病理生理机制。目前,已有多篇文献报道,TGF-beta水平升高与感染性疾病存在相关性,其受体发挥了非常重要的作用。在细胞膜水平上,TGF-β与受体激酶结合,将磷酸化信号传递到下游介质（主要是SMAD蛋白）,并且将寡聚化依赖性信号传递给泛素连接酶和细胞内蛋白激酶等。SMADs与其他信号蛋白之间的相互作用介导调控信号,控制靶基因的表达、多水平的RNA加工、mRNA翻译以及核或细胞质蛋白调控。其中,TGF-beta受体Ⅱ同胞外配体发生互作后,一方面,通过经典途径,使核转录因子进入细胞核调控转录翻译从而发挥损伤修复以及促进上皮细胞-间充质转化（EMT）的作用;另一方面,作为非经典途径,受体Ⅱ可以直接调控Rho-ROCK通路影响应力纤维形成、改变细胞骨架并影响细胞间连结蛋白,从而影响内皮细胞通透性。通过前期研究发现,在HBP的刺激下,SMAD2/3磷酸化水平升高,因此推测,TGF-beta受体Ⅱ可能为HBP在内皮细胞表面的潜在蛋白受体。本实验拟通过HBP诱导原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）及C57BL/6小鼠模型模拟HBP血症,针对肝素结合蛋白（HBP）影响内皮细胞通透性这一热点问题,拟探索HBP在内皮细胞表面的潜在受体,填补相关实验空白。在此基础上,探究在HBP刺激下内皮细胞通透性改变与TGF-β信号通路的关系,进一步探索HBP影响内皮细胞通透性的机制,以期为临床从病因学的角度预防和治疗器官功能不全提供新的思路和重要的生物医学证据。研究方法:1.体外实验:本研究所使用的人脐静脉内皮细胞取自人脐静脉,为原代细胞（公司购买）。培养HUVEC,用PBS和HBP（10ug/ml）刺激培养0h、24h、48h和72h,用CCK-8检测细胞活力。2.体外实验:本实验研究选取HUVEC、HLMVEC作为实验对象,培养内皮细胞并分别给予HBP刺激（10ug/ml）0小时、3小时、6小时、以及9小时,通过 Western Blot 检测 SMAD2/3 及 phosph-SMAD2/3 蛋白的表达。3.体外实验:通过小干扰RNA转染的方法,将TGFBR2siRNA（50nM）转染进细胞中。培养内皮细胞并给予HBP刺激（10ug/ml）,将实验分为4组:对照组,HBP刺激组,TGFBR2siRNA组以及TGFBR2siRNA+HBP组。在加入刺激因素前加入50nM TGFBR2siRNA预处理48-72小时。HBP（10ug/ml）与内皮细胞共培养3小时。通过Western Blot检测SMAD2/3、phosph-SMAD2/3蛋白的表达情况。4.体外实验:通过培养内皮细胞并给予HBP刺激（10ug/ml）以及SMAD3抑制剂常山酮（halofuginone）将实验分为4组:对照组,HBP刺激组,常山酮组以及常山酮+HBP组。在加入刺激因素前加入10ng/ml常山酮预处理24小时。通过Western Blot检测SMAD2/3及phosph-SMAD2/3蛋白的表达情况。5.体外实验:通过免疫共沉淀实验、免疫荧光共定位以及GST-pulldown探究HBP与TGFBR2是否结合以及结合的区域。6.体外实验:通过培养内皮细胞并给予HBP刺激以及TGFBR2siRNA（50nM）将实验分为4组:对照组,HBP刺激组,TGFBR2siRNA组以及TGFBR2siRNA+HBP组。通过Western Blot以及免疫荧光检测SMAD2/3在细胞质以及细胞核中的分布变化。7.体外实验:在transwell上室培养内皮细胞并给予HBP刺激（10ug/ml）以及TGFBR2siRNA（50nM）将实验分为4组:对照组,HBP刺激组,TGFBR2siRNA组以及TGFBR2siRNA+HBP组。在上室培养基中加入FITC-dextran,通过检测下室培养基中FITC-dextran的浓度来观察内皮细胞通透性的变化。8.体外实验:培养内皮细胞并给予HBP刺激（10ug/ml）以及TGFBR2siRNA（50nM）将实验分为4组:对照组,HBP刺激组,TGFBR2siRNA组以及TGFBR2siRNA+HBP组。通过Western Blot以及免疫荧光检测内皮细胞骨架、紧密连接蛋白（TJP1,OCLN）以及总Rho蛋白的表达情况。通过qPCR检测紧密RhoA、RhoB的转录情况。9.体内实验:雄性C57BL/6,随机分组,每组3只,体重25±5g。实验前于动物饲养中心饲养7天,正常提供水和食物,观察无明显异常后开始实验。采用随机对照实验设计,以生理盐水作为阴性对照。实验时将小鼠随机分成4组,对照组（生理盐水组,n=3）,TGFBR2siRNA组（尾静脉注射,20nmol/只）,HBP组（尾静脉注射,150ug/只）,TGF-beta受体抑制剂+HBP组。造模结束后处死小鼠,取肺组织进行试验。通过肺湿干比来检测肺水含量的变化;通过Western Blot实验检测紧密连接蛋白（TJP1,OCLN）以及总Rho蛋白的表达情况;通过qPCR检测RhoA、RhoB的转录情况;通过H&E染色以及扫描电镜观察肺组织的渗出出血等损伤情况;通过透射电镜（TEM）观察气血屏障的损伤情况。结果:1.随HBP刺激时间的延长,HUVECs细胞活力升高。2.在HBP刺激下的内皮细胞,细胞内phosph-SMAD2/3水平出现明显升高,而SMAD2/3水平未发生明显改变。3.经TGFBR2siRNA转染处理过的细胞组,其TGFR2蛋白水平下降明显。同对照组相比,HBP刺激组细胞内phosph-SMAD2/3水平出现明显升高,而其他三组phosph-SMAD2/3水平未出现明显变化。4.同对照组相比,HBP刺激组细胞内phosph-SMAD2/3水平出现明显升高,而其他三组phosph-SMAD2/3水平未出现明显变化。5.免疫共沉淀与免疫荧光共定位实验证实HBP与TGFBR2之间存在相互作用;GST pull-down及截短实验证实HBP与TGFBR2的胞外段存在直接结合关系。6.内皮细胞Western Blot以及免疫荧光实验发现同对照组相比,HBP刺激组细胞内SMAD2/3蛋白由细胞质向细胞核转移,而其他三组未出现明显变化。7.Transwell实验发现同对照组相比,HBP刺激组下室培养基中FITC-dextran的浓度显著升高,而TGFBR2siRNA处理可以起到一定程度的抑制作用。8.Western Blot以及qPCR结果发现,同对照组相比,HBP刺激组细胞内总Rho蛋白水升高,紧密连接蛋白（ZO-1）未发生明显变化,而其他三组未出现明显变化。此外,在HBP刺激下,RhoA、RhoB的转录水平均有不同程度的升高,而TGFBR2siRNA处理可以一定程度上抑制转录水平的变化;荧光结果表现为,HBP刺激下内皮细胞内应力纤维分布紊乱也生成增加,紧密连接蛋白荧光强度减弱,而其他三组未出现明显变化。9.体内实验方面,HBP组小鼠肺组织的总Rho蛋白水平升高,其中RhoA、RhoB的转录水平升高;紧密连接蛋白occludin蛋白水平下降,而ZO-1蛋白水平未发生明显变化;phosph-SMAD2/3蛋白水平升高,SMAD2/3蛋白水平无明显变化,TGFBR2siRNA处理可以一定程度上抑制蛋白以及mRNA的变化。肺湿干比结果发现,和对照组相比,HBP刺激组小鼠肺组织含水量增加（5.1833±0.23214 vs.4.0224±0.18561,p<0.01）,而 TGFBR2siRNA+HBP 处理可以起到一定程度的抑制作用（4.1976±0.04377 vs.5.1833±0.23214,p<0.01）。H&E染色结果发现,对照组肺泡开放,肺泡壁、肺泡隔形态清晰。HBP组肺泡部分塌陷或膨胀不良,肺泡壁及肺泡隔明显增宽,肺泡隔充血肿胀,内有大量炎症细胞浸润。TGFBR2siRNA+HBP组肺泡隔肿胀增宽程度低于HBP组,炎症细胞浸润减少。电镜方面,发现在HBP刺激下肺泡表面蛋白渗出明显,正常肺泡结构消失,气血屏障结构紊乱,细胞间连结打开,通透性增加。TGFBR2siRNA处理可以起到一定程度的保护作用。结论:1.HBP肝素结合蛋白通过结合TGFBR2激活TGF-β通路,上调Rho蛋白水平,激活Rho-ROCK通路促进细胞骨架重构、应力纤维形成、改变紧密连接蛋白（ZO-1）的分布情况。2.HBP肝素结合蛋白通过激活TGF-β通路使内皮细胞通透性升高、诱导急性肺损伤,而敲减TGFBR2蛋白水平可以部分拮抗HBP的生物学效应。