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目的:从组织、细胞和分子层面,研究RUNX3、miR-10b-5p与TIAM1之间上下游的靶向调控关系,进而证明其在胃癌细胞增殖、侵袭和迁移生物学行为的信号通路途径及作用机制。方法:1.预测miRNAs:通过生物信息学分析方法,利用现今人类miRNAs信息收录覆盖较为全面、靶基因预测算法较为科学合理且科研应用较为广泛的七个常见在线预测miRNAs的数据库,Targetscan、miRNet、miRWalk、miRDB、Micro T-CDS、miRSystem和miRNAMap,预测可能靶向TIAM1 mRNA 3’-UTR的miRNAs,选取至少出现在3个数据库的11种miRNAs进行实验验证。2.验证miR-10b-5p和TIAM1的靶向关系:(1)胃癌细胞系BGC823中分别转染11种miRNAs的模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors),使相应miRNAs过表达或抑制后,提取细胞中总RNA,逆转录后通过RT-q PCR检测TIAM1mRNA变化。(2)TIAM1 mRNA 3’-UTR全长序列构建到psi CHECKTM-2载体中海肾荧光素酶基因(Renilla luciferase)的3’端,在胃癌细胞系BGC823中,通过双荧光素酶实验,验证miRNAs和TIAM1 mRNA 3’-UTR的作用关系。3.miR-10b-5p在胃癌组织和细胞系中的表达情况:通过RT-q PCR方法,(1)检测50例临床组织标本(包括25例胃癌组织和25例对应癌旁5cm正常组织)中miR-10b-5p的表达;(2)检测4株细胞系(包括3株胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901和1株正常胃粘膜上皮细胞系GES-1)中miR-10b-5p的表达。4.miR-10b-5p抑制胃癌细胞增殖、迁移侵袭、集落形成和促进凋亡作用:在胃癌细胞系BGC823中转染miR-10b-5p-mimic或miR-10b-5p-inhibitor后,(1)通过CCK-8试验检测胃癌细胞BGC823在0h、24h、48h、72h时OD450nm处的吸光度值,细胞数量越多则吸光度值越高,进而观察miR-10b-5p对胃癌细胞增殖能力的影响。(2)通过Transwell小室侵袭迁移试验,计数胃癌细胞BGC823穿过未包被基质胶的膜的细胞个数,迁移能力越强则穿过越多,也计数胃癌细胞BGC823穿过包被基质胶的膜的细胞个数,侵袭能力越强则穿过越多,进而观察miR-10b-5p对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。(3)通过集落形成试验计数胃癌细胞BGC823集落形成的数量,集落形成能力越强则细胞集落数量越多,进而观察miR-10b-5p对于胃癌细胞集落形成能力的影响。(4)通过流式细胞术检测胃癌细胞BGC823早期凋亡细胞群的数量百分比,进而观察miR-10b-5p对胃癌细胞凋亡的影响。5.RUNX3对miR-10b-5p和TIAM1表达的调控:(1)通过RT-q PCR方法,用上述检测miR-10b-5p的50例组织标本检测RUNX3的表达,并分析与miR-10b-5p的相关性;(2)通过RT-q PCR方法,在胃癌细胞系BGC823中转染RUNX3表达载体(包括2个亚型RUNX3-1和RUNX3-2)后检测miR-10b-5p和TIAM1的表达;(3)构建RUNX3胃癌相关单碱基突变(包括RUNX3-1-R122C和RUNX3-2-R136C)质粒,转染突变质粒RUNX3-1-R122C和RUNX3-2-R136C后,检测miR-10b-5p的表达,观察RUNX3胃癌相关单碱基突变后是否仍然影响miR-10b-5p的表达;(4)通过Western blot方法,在胃癌细胞系BGC823中共同转染RUNX3表达载体和miR-10b-5p-inhibitor后,检测对Tiam1蛋白的影响。6.RUNX3抑制胃癌细胞增殖、迁移侵袭、集落形成和促进凋亡作用:通过CCK-8试验、Transwell小室侵袭迁移试验、流式细胞术检测凋亡和集落形成实验观察RUNX3对胃癌增殖、侵袭迁移、集落形成和凋亡的影响。7.CBFβ辅助RUNX3调控miR-10b-5p表达:慢病毒转染构建CBFβ稳定低表达的胃癌细胞系,通过RT-q PCR方法,在CBFβ稳定低表达细胞系中(1)检测miR-10b-5p的表达,观察细胞缺乏CBFβ情况下,miR-10b-5p表达的改变;(2)转染RUNX3表达载体后检测miR-10b-5p的表达,观察细胞缺乏CBFβ情况下,RUNX3是否还能上调miR-10b-5p表达;(3)共同转染RUNX3和CBFβ表达载体后检测miR-10b-5p的表达,观察将细胞内CBFβ补足的情况下,RUNX3是否能恢复对miR-10b-5p的上调作用。8.CBFβ辅助RUNX3抑制胃癌细胞增殖和侵袭迁移:在CBFβ稳定低表达细胞系中,(1)转染RUNX3表达载体后,通过CCK-8试验和Transwell小室侵袭迁移试验,观察细胞缺乏CBFβ情况下,RUNX3是否还能抑制胃癌增殖和侵袭迁移;(2)共同转染RUNX3和CBFβ表达载体后,通过CCK-8试验和Transwell小室侵袭迁移试验,观察将细胞内CBFβ补足的情况下,RUNX3是否能恢复对胃癌细胞增殖和迁移侵袭的抑制作用。9.CBFβ和RUNX3对miR-10b-5p前体序列上游可能的启动子区域的影响:将miR-10b-5p的前体序列上游可能的启动子区域(-2268~-170)从正常胃粘膜上皮细胞系GES-1基因组DNA中扩增下来,并且扩增出4种不同长度的截短序列(P-pro A:-2268~-170、P-pro B:-1764~-170、P-pro C:-1266~-170、P-pro D:-732~-170),将四段序列分别构建在p GL3-basic载体上萤火虫荧光素酶基因(Firefly Luciferase)的5’端。在胃癌细胞系BGC823中,(1)转染构建的启动子截短片段质粒,通过荧光素酶实验,若检测出荧光素酶活性,说明有荧光素酶表达,则说明扩增的片段具有启动子活性;(2)共转染启动子截短片段质粒和RUNX3表达载体,通过荧光素酶实验检测荧光素酶活性变化,荧光素酶活性变化间接反映截短片段启动子活性变化,从而观察RUNX3对截短片段的启动子活性影响;(3)共转染启动子截短片段质粒、RUNX3表达载体和CBFβ表达载体,通过荧光素酶实验检测荧光素酶活性变化,观察在CBFβ存在的情况下,RUNX3对截短片段的启动子活性影响。结果:1.筛选出miR-10b-5p靶向作用于TIAM1 mRNA-3’-UTR调控其表达(1)生物信息学方法预测并选取11种靶向TIAM1 mRNA 3’-UTR的miRNAs中,其中8种(包括miR-10b-5p、miR-589-3p、miR-651-3p、miR-335-3p、miR-653-5p、miR-373-3p、miR-372-3p和miR-205-3p)对TIAM1 mRNA的表达有不同程度的影响,且具有统计学意义,而miR-4770、miR-592和miR-7844-5p不影响TIAM1 mRNA的表达。(2)双荧光素酶实验表明对TIAM1 mRNA表达有影响的以上8个miRNAs中,仅有miR-10b-5p能够影响TIAM1 mRNA 3’-UTR,且具有统计学意义。2.miR-10b-5p在胃癌组织和细胞系中低表达及抑制胃癌细胞增殖、侵袭迁移、集落形成和促进凋亡(1)miR-10b-5p在胃癌组织中的表达低于癌旁5cm的正常组织,且具有统计学意义(p=0.0064),在胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901中的表达低于人正常胃粘膜上皮细胞系GES-1,且具有统计学意义。(2)胃癌细胞系BGC823中转染miR-10b-5p-mimic后,在0h、24h、48h、72h时OD 450nm处吸光度值增加的幅度明显低于对照组,穿过Transwell小室的细胞数量明显减少,集落形成的数量明显减少,凋亡细胞群百分比增加;转染miR-10b-5p-inhibitor后在0h、24h、48h、72h时OD 450nm处的吸光度值增加的幅度明显高于对照组,穿过Transwell小室的细胞数量明显增多。3.RUNX3调控miR-10b-5p和TIAM1表达且抑制胃癌细胞增殖、迁移侵袭、集落形成、促进凋亡(1)RUNX3在胃癌组织中的表达低于癌旁5cm的正常组织,且与miR-10b-5p表达呈正相关(r=0.3725),相关性具有统计学意义(p=0.0231)。(2)胃癌细胞系BGC823中转染RUNX3表达载体后,RUNX3的2个亚型RUNX3-1和RUNX3-2均能升高miR-10b-5p表达3~4倍左右,且具有统计学意义;胃癌细胞系BGC823中转染RUNX3突变载体RUNX3-1-R122C后,miR-10b-5p的表达下降至与对照组相同,且具有统计学意义,转染RUNX3-2-R136C后,miR-10b-5p的表达仅有下降趋势。(3)胃癌细胞系BGC823中转染RUNX3后,胃癌细胞在0h、24h、48h、72h时OD 450nm处的吸光度值增加的幅度明显低于对照组,穿过Transwell小室的细胞数量明显减少,集落形成的数量明显减少,凋亡细胞群百分比增加。(4)胃癌细胞系BGC823中转染RUNX3表达载体后,RUNX3的2个亚型中,RUNX3-1降低TIAM1 mRNA表达2倍左右,且具有统计学意义,RUNX3-2对TIAM1 mRNA仅具有减低趋势。共同转染RUNX3-1和miR-10b-5p-inhibitor后,RUNX3-1失去对Tiam1蛋白表达的抑制作用。4.CBFβ辅助RUNX3上调miR-10b-5p且抑制胃癌细胞增殖和侵袭迁移(1)CBFβ稳定低表达的胃癌细胞系比普通胃癌细胞系中miR-10b-5p的表达减低2倍左右,且具有统计学意义。CBFβ稳定低表达的胃癌细胞系中,单独转染RUNX3-1组与对照组相比,miR-10b-5p没有上升;共转RUNX3-1和CBFβ组与对照组相比,miR-10b-5p升高2倍左右。CBFβ稳定低表达的胃癌细胞系中单独转染RUNX3-2组与对照组相比,miR-10b-5p升高1.5倍左右;共转RUNX3-2和CBFβ组与对照组相比,miR-10b-5p升高2.5倍左右。共转RUNX3和CBFβ比单独转染RUNX3具有更强的上调miR-10b-5p表达的作用。(2)CBFβ稳定低表达的胃癌细胞系中单独转染RUNX3-1组与对照组相比,OD 450nm处吸光度值增加幅度无变化,侵袭迁移穿过Transwell小室的细胞数量无明显变化;共转RUNX3-1和CBFβ组,与单独转染RUNX3-1组和对照组相比,OD 450nm处的吸光度值在72h时增加的幅度最小,侵袭迁移穿过Transwell小室的细胞数量最少,具有统计学意义。CBFβ稳定低表达的胃癌细胞系中单独转染RUNX3-2组与对照组相比,OD 450nm处吸光度值在72h时增加的幅度明显减低,侵袭迁移穿过Transwell小室的细胞数量明显减少,具有统计学意义;共转RUNX3-2和CBFβ组,与单独转染RUNX3-2组和对照组相比,OD 450nm处的吸光度值在48h和72h时增加的幅度最小,侵袭迁移穿过Transwell小室的细胞数量最少,具有统计学意义。共转RUNX3和CBFβ比单独转染RUNX3具有更强的抑制增殖和侵袭转移的作用。(3)胃癌细胞系BGC823中转染构建的含有miR-10b-5p前体序列上游四个截短片段(P-pro A:-2268~-170、P-pro B:-1764~-170、P-pro C:-1266~-170、P-pro D:-732~-170)的p GL3质粒,荧光素酶实验均能检测到荧光素酶表达,即四个截短片段均具有启动子活性;四个片段中转染p GL3-P-pro A时显示出的荧光素酶活性最高,且受到RUNX3影响最大;共同转染RUNX3、CBFβ和p GL3-P-pro A时,比转染RUNX3和p GL3-P-pro A时,荧光素酶活性更高。结论:(1)RUNX3在胃癌组织中呈低表达趋势且与miR-10b-5p表达呈正相关,miR-10b-5p在胃癌组织和细胞系中低表达,TIAM1在胃癌细胞系中呈高表达,证明RUNX3、miR-10b-5p和TIAM1三者在表达上具有相关性。(2)在体外胃癌细胞系中CBFβ辅助RUNX3上调miR-10b-5p的表达,miR-10b-5p靶向作用于TIAM1 mRNA-3’UTR后抑制TIAM1表达,RUNX3抑制TIAM1表达,抑制miR-10b-5p后RUNX3失去对Tiam1蛋白的抑制作用,证明RUNX3通过上调miR-10b-5p抑制TIAM1 mRNA的表达。(3)在体外胃癌细胞系中CBFβ辅助RUNX3抑制胃癌细胞的增殖和侵袭迁移,RUNX3抑制胃癌集落形成且促进凋亡,miR-10b-5p抑制胃癌的增殖、侵袭迁移、集落形成且促进凋亡,证明CBFβ辅助RUNX3可通过上调miR-10b-5p发挥生物学作用。(4)本研究首次证明了CBFβ辅助RUNX3通过上调miR-10b-5p抑制TIAM1表达,进而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭迁移。