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新生儿缺氧缺血性脑损伤(neonatal hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是导致新生儿死亡和儿童神经系统伤残的主要原因之一,目前对重度HIBD尚无特异有效的治疗办法。近年来随着干细胞研究的进展,干细胞移植为新生儿HIBD的治疗开辟了一条新途径。干细胞移植是近年来整个生命科学领域和医学领域的研究热点和前沿,因其具有高度自我更新能力和多向分化潜能而成为细胞移植和组织工程中的首选细胞。造血干细胞／祖细胞(hematopoietie stem cell/hematopoietic progenitor cell,HSC/HPC)存在于人脐血(human umbilical cord blood,HUCB)中,脐血中造血干细胞被成功的发现并已经在临床中用于异体细胞移植治疗血液系统疾病。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是否存在于脐血中仍不十分明确。最近几年的研究中显示,在脐血里能培养出MSCs来,脐血MSCs与骨髓MSCs具有相近的性质,并有多向分化潜能,它处于一定的环境中就能定向分化为神经元和神经胶质细胞。脐血MSCs移植治疗在缺氧缺血性脑损伤和脑脊髓损伤的动物实验中,观察到移植细胞在脑组织内神经元和神经胶质细胞标志物的表达和神经功能的恢复。但是,在临床上治疗一些疾病时发现单份脐血细胞数量不足,为实验研究和临床工作带来了一些困扰,又有文献报道两份脐血混合培养后细胞增殖快,数量多,为弥补临床应用单份脐血MSCs数量不足提供了良好的理论依据。目的观察是否能从健康足月新生儿脐血中培养出脐血间充质干细胞(MSCs),观察混合培养的脐血间充质干细胞和单份培养的脐血间充质干细胞的增殖情况,探讨脑内移植混)合培养的人脐血间充质干细胞(MSCs)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗效果。为进一步进行脐血MSCs移植治疗新生儿HIBD的临床应用,提供实验基础和理论根据。I方法无菌条件下收集20份健康足月新生儿脐血,采用密度梯度离心法分离出脐血单个核细胞,再通过贴壁细胞培养法培养出人脐血MSCs。当细胞传至第3代时,随机取培养的8份脐血间充质干细胞(半量)为A组,8份脐血间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量脐血间充质干细胞混合为C组。3组细胞密度均为1.0×106/ml。混合培养的第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD86、CD34、HLA-DR、HLA-ABC的表达。选择P3代人脐血MSCs作为移植细胞,并经5-溴-2脱氧尿苷(BrdU)体外标记。7日龄SD大鼠50只制备HIBD模型,造模过程中死亡3只,随机选择5只进行HE染色,剩余42只分为混合移植组(n=16)和单份移植组(n=16)和对照组(n=10)。造模后第3天,在立体定位条件下,移植组大鼠经左侧大脑皮层注入人脐血MSCs,对照组在相同部位注入相同体积的PBS。在细胞移植后第7天,各随机选择6只移植组大鼠处死取脑,通过脑组织免疫组织化学检测方法观察移植细胞在脑内的存活、迁移情况。于移植后第1、7、14、21、28天采用改良神经行为学评分(mNSS)方法对三组大鼠的神经功能进行评价。结果活细胞计数显示,将2份不同脐血间充质干细胞混合培养后,细胞增殖比单份脐血间充质干细胞快(P<0.05)。造模后HE染色可见大脑皮层神经细胞数量减少,胞质皱缩,核浓缩深染,核仁消失,胞浆疏松,间质水肿。海马区锥体细胞变性,细胞间隙增大,排列紊乱。移植7天后移植组大鼠脑组织免疫组织化学检测发现移植细胞在脑内能够存活,并以移植点为中心向周围迁移,混合移植组的BrdU阳性细胞数多于单份组(P<0.05)。mNSS检测结果显示,移植后第1天移植组大鼠mNSS低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),第7、14、21、28天移植组大鼠mNSS低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。第7、14、21、28天混合移植组大鼠的mNSS低于单份移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1在适宜的体外培养条件下,可以从健康足月新生儿脐血中成功地培养出MSCs,脐血MSCs的免疫表型符合间充质干细胞特征。2混合培养的人脐血MSCs增殖比单份培养人脐血MSCs快。3混合培养的人脐血MSCs脑内移植可能对HIBD新生大鼠的脑功能具有改善作用。